导致黄酒酸败的食果糖乳杆菌的分离、鉴定及其检测条件优化

章志超，吴 鑫*，朱应飞

（江西省食品检验检测研究院，江西国家果蔬产品及加工食品质量监督检验中心，江西 南昌 330001）

黄酒是源于中国的特色古酒，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1]。它是以大米、黍米、粟为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿造而成的发酵酒，按照产品风格分为传统型黄酒、清爽型黄酒和特型黄酒[2]。它具有乙醇体积分数低、酒性醇厚、营养丰富和风味独特等特点[3]，在日常饮用、烹饪和保健等方面的应用广泛，越来越受消费者的青睐。

黄酒由于乙醇含量低，多为开放式发酵，若生产灭菌不彻底、 贮藏或运输过程中容易染菌而发生酸败，主要表现为酒液浑浊沉淀，生酸腐败或白色菌膜形成，甚至异味发臭，严重影响产品质量[4-5]。该问题是我国黄酒行业亟需解决的问题之一。导致黄酒生物性酸败的微生物多种多样，如酵母、醋酸菌、假单胞菌、乳酸菌和芽孢杆菌等[6-10]。目前关于黄酒的国家标准中对黄酒的卫生控制仅限于金黄色葡萄球菌和沙门菌[11]，食品安全抽检项目中也无针对性检测项目及相应的检验方法[12]，食品安全风险显而易见。

虽然乳酸杆菌导致的黄酒酸败问题时有报道，但因食果糖乳杆菌导致的黄酒酸败问题则较为少见，按照食品安全国家标准对乳酸菌的检测方法则呈培养周期较长的特点，出现了方法适用性不佳等问题，制约了该菌的检出时效。本研究在通过形态学、生化实验和16S rRNA基因等方法选择性筛选出目标腐败菌——食果糖乳杆菌（Lactobacillus fructivorans）的基础上，针对国标方法的不足进一步采用单因素和Box-Behnken响应面试验对目标腐败菌的检测条件进行优化，大大缩短了该菌定量检出时间，为评估黄酒该类酸败严重程度，解决相关食品安全问题提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒，因微生物自然污染，呈浑浊、异味的某品牌黄酒变质样品A和同品牌同批次的质量正常样品B。

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、MRS（man rogosa sharpe）琼脂、MRS肉汤、孟加拉红培养基（rose bengal agar，RBA）、结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar，VRBA）、乳酸杆菌生化鉴定套装北京陆桥生物技术有限公司；其他常规化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ZXSD-A1430生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；AW200SG 厌氧工作站 英国Electrotek公司；C1000touch型聚合酶链式反应仪 美国伯乐公司；BG-Power300型电泳仪 美国Baygene公司。

1.3 方法

1.3.1 总酸的测定

参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[13]方法进行测定。

1.3.2 菌落计数

菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[14]进行测定；大肠菌群：参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》[15]进行测定；霉菌：参照GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[16]进行测定；乳酸菌：参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》[17]进行测定。

1.3.3 目标腐败菌的分离、鉴定

参照焦唯桢等[18]的方法，对优势菌进行培养，纯化和镜检，并对分离的纯菌株进行16S rRNA基因鉴定，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序工作，将结果与NCBI中收录的其他菌株序列进行比对分析，并运用MEGA 5.1软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.3.4 菌悬液的制备、接种

将筛选纯化得到的菌株于MRS肉汤培养基中活化2 次，再以2%接种量接种于MRS肉汤培养基中，36 ℃培养约48 h，使菌悬液浓度达到8（lg（CFU/mL）），再用生理盐水稀释菌液，使最终浓度约为4～5（lg（CFU/mL））（接近黄酒样品的实际微生物污染水平）。

1.3.5 单因素试验设计

在GB 4789.35—2016中乳酸菌检测条件的基础上，从分离菌株的生长促进因子、pH值和温度等方面进行单因素试验分析。单因素试验基本条件设计为MRS固体培养基、pH 6.2、温度36.0 ℃[17]。在其他因素不变的情况下，改变其中一个因素，各因素设计的水平梯度为pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；培养温度27、30、33、36、39、42 ℃；L-半胱氨酸（L-Cys）质量分数0.025%、0.075%、0.125%、0.175%、0.225%；无水乙醇体积分数1%、3%、6%、9%、12%；培养9 d后观察菌落生长情况。

1.3.6 响应面试验优化

根据单因素试验结果，选取培养基pH值、培养温度、培养基中L-Cys质量分数和乙醇体积分数4 个因素作为自变量，以培养7 d的目标腐败菌的菌落数作为响应值，进行Box-Behnken响应面设计。每个试验重复3 次，取其平均值，因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.7 优化后的方法确证

分别采用GB 4789.35—2016和优化后的方法对变质样品A或正常样品B中乳酸菌数进行检测，比较检出数量和检出时间。

1.4 数据处理与分析

每个实验重复3 次，数据统计分析采用Microsoft Excel 2007，结果以“ ±s”表示。采用Design-Expert 8.05软件进行Box-Behnken响应面分析。

2 结果与分析

2.1 目标腐败菌的分析

表2 不同培养基对黄酒中微生物的菌落计数Table 2 Bacterial colony counts of Rancid Chinese rice wine using different culture media

采用多种常见的非选择/选择性培养基对变质样品和正常样品中可能存在的微生物进行培养，结果如表2所示：两类样品在整个培养过程中，PCA、VRBA和RBA上均无菌落生长；当使用MRS选择性固体培养基时，培养到第9天，变质样A中菌落数达到（4.43±0.03）（lg（CFU/mL）），而正常样中则未检出乳酸菌。正常成品黄酒中无微生物生长，这与市售黄酒经灭菌工艺，本身菌含量极低，加上其特有的含醇环境有关，而变质黄酒中生长的微生物可能也较为单一。同时通过对样品总酸（以乳酸计）的测定，变质样品A的总酸值是同批次正常样的3 倍，章银珠等[9]研究的4种坛装陈化黄酒酸败后总酸（以乳酸计）仅上升了30%～60%，因此推断导致黄酒酸败变质的优势腐败微生物可能为乳酸菌，且产酸能力较强。黄酒中总酸的上升则可能与乳酸菌代谢糖类产生乳酸有密切关系[19]。

2.2 乳酸菌的鉴定

采用倾注法MRS培养的平板上长出的菌如图1A所示，均为乳白色，其中长在培养基内部的菌落呈三角形，表面不规则，如菌ZH-1；表面菌落呈圆形，表面光滑，如菌ZH-2。挑取纯化这2 种菌进行革兰氏染色，结果如图1B所示，选取的两株菌均为革兰氏阳性菌、杆菌，因此推测筛选得到的菌ZH-1和菌ZH-2可能均为乳酸杆菌。按照GB 4789.35—2016的方法进行初步生化鉴定，表3表明：2 株菌的碳水化合物生化反应一致，对照文献[20-21]，与之类似的菌为食果糖乳杆菌，且文献[20]中指出该菌具有生长缓慢的特点，与本实验观察到的现象吻合。

图1 筛选菌株的菌落形态（A）和菌体形态（B）Fig. 1 Morphological characteristics of colonies (A) and Gram-staining of isolated bacteria (B)

表3 乳杆菌属种内常见碳水化合物生化反应Table 3 Carbohydrate fermentation characteristics of L. fructivorans

图2 根据菌ZH-1和菌ZH-2的16S rRNA基因构建的系统发育进化树Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of ZH-1 and ZH-2

对2 株菌的16S rRNA基因进行鉴定，由细菌DNA为模板，以引物27F、1495R进行聚合酶链式反应扩增，得到约1 500 bp的目的片段，测序结果显示：代表性菌株ZH-1和ZH-2的16S rRNA基因片段长度分别为1 484 bp和1 483 bp。将测序结果用NCBI中BLASTn进行序列同源性分析，菌ZH-1和菌ZH-2均为乳杆菌属，且这两株菌均与L. fructivorans NBRC 14747（AB680654.1）和L. homohiochii DSM 20571（NR_114976.1）的相似度最高，相似度为99%。为进一步明确菌株种属关系，以比对相似度较高的报道菌株及同属的模式菌株为参照构建系统发育树，如图2所示，菌株ZH-1和ZH-2与L. fructivorans NBRC 14747（AB680654.1）聚为一簇，说明分离得到的这两株菌为食果糖乳杆菌，与生化反应结果相对应。

2.3 目标腐败菌的确定

表4 黄酒中接种菌株ZH-1和ZH-2后的感官和总酸变化Table 4 Sensory evaluation and changes in total acid concentration of Chinese rice wine inoculated with ZH-1 or ZH-2

如表4所示，为验证分离菌为目标腐败菌，实验中将分离得到食果糖乳杆菌ZH-1和食果糖乳杆菌ZH-2分别接种于正常黄酒中，30 ℃培养2 d后，黄酒呈浑浊、腐败异味，且总酸分别升高了（0.27±0.02）g/100 mL和（0.20±0.02）g/100 mL，变化显著，与自然污染的黄酒样品呈现的腐败特征一致，因此可以判断食果糖乳杆菌是导致该黄酒酸败的原因。乳酸杆菌导致的黄酒酸败问题报道较多[6,8-9,19]，但多数文献中除对致腐乳酸杆菌形态进行简单描述外，无更具体的菌株鉴定数据及菌株种属信息。食果糖乳杆菌首次在腐败的沙拉调味汁中被发现[22]，常生长在一些腐败的酸性或含乙醇的食物中[22-25]，这与黄酒的特性相符。食果糖乳杆菌一般较难分离得到[26]，但发现于酸败的黄酒中则更少报道，且分离得到的食果糖乳杆菌具有发酵产酸能力强的特点。

2.4 目标腐败菌培养条件的优化

2.4.1 单因素试验结果

图3 不同因素对食果糖乳杆菌生长的影响Fig. 3 Effect of different factors on L. fructivorans growth

在GB 4789.35—2016的检测方法的基础上，对目标腐败菌培养条件进行优化。培养至第9天，菌落生长情况如图3所示，当改变MRS固体培养基的pH 5.5时，肉眼可计数菌落最多，达到（4.89±0.05）（lg（CFU/mL）），pH值为5.0、6.0和6.5时，均有菌落生长，但均显著低于pH 5.5的情况，其他pH值条件下则未发现菌落生长；目标腐败菌在30～42 ℃时，可计数菌落呈下降趋势，其中培养温度为30 ℃时目标菌生长最快，培养至第7天即可见微小菌落生长； L-Cys作为一种还原剂能够降低系统的氧化还原电位，加入培养基中能够形成更好的厌氧环境，且L-Cys上具有的巯基可作为一些酶的重要小分子底物，促进菌的其他生长代谢[27-30]。考虑到黄酒陈化、贮藏的厌氧或微氧环境，乙醇体积分数不低于8%的特征，且一些报道指出食果糖乳杆菌可能有嗜醇性[21]，为更好地契合目标腐败菌的实际生长环境，研究考虑将L-Cys和无水乙醇作为目标腐败菌的生长促进因子。添加一定量的L-Cys或乙醇能够促使目标菌显著生长：L-Cys的质量分数在0.075%时，可计数的目标菌数最多；乙醇体积分数为6%时，目标菌则生长最好。

2.4.2 响应面试验方案设计与结果

根据Box-Behnken响应面试验设计原理，进行29 次试验，序号25～29为5 次重复的中心试验，其余为析因点试验。对表5中数据进行多元回归拟合得到菌落数Y对各因素编码值的回归方程：

同时对回归模型进行方差分析，如表6所示，方程极显著，拟合优度R2为0.98，拟合性较好，说明该方程能够很好地反映响应值与各因素间的对应关系。由P值可以看出：一次项极显著，一次项X2显著，其余不显著。由于二次回归正交旋转组合试验具有正交性，可以删除方程中不显著项[27]，得到方程如下：

由F值大小可以判断各试验因素对响应值影响：pH值＞L-Cys质量浓度＞培养温度＞乙醇体积分数。

表5 Box-Behnken响应面试验设计及结果Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the regression model

2.4.3 响应面交互作用分析与优化

图4 不同显著性因素对食果糖乳杆菌生长影响的响应面Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of various significant factors on the growth of L. fructivorans

为进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点，绘制响应面曲线图可进行直观分析。将没有显著性影响的自变量设为零，观察具有显著性因素间的交互作用。如图4所示，各显著因素在设定的变化范围内均有最大值，食果糖乳杆菌菌落数较大的培养条件范围分别为pH 5.4～5.6、培养温度30～31 ℃、L-Cys质量分数0.07%～0.10%。采用Design-Expert软件的Optimization模块，对食果糖乳杆菌的培养条件进行优化，得到最佳培养检测条件：在MRS固体培养基基础上，调整pH值为5.42、培养温度为30.31 ℃、L-Cys质量分数为0.079%、乙醇体积分数为9%，对应的模型预测值为（6.04±0.05）（lg（CFU/mL））。结合实际操作的方便和方差分析结果，确定最佳培养条件为：在MRS固体培养基基础上，添加质量分数0.08%的L-Cys，调节pH值为5.4，临用时加入体积分数9%的无水乙醇，培养温度为30 ℃，采用优化后的培养条件检测分离的食果糖乳杆菌，培养7 d，实验值为（5.94±0.03）（lg（CFU/mL）），与预测值接近，可见该模型能较好地预测目标菌的生长。

2.4.4 检测方法的确证结果

表7 国标方法和优化后的方法对样品中目标腐败菌检测效果评价Table 7 Comparative assessment of GB 4789.35-2016 and the optimization method

为验证优化后的检测方法能够更好地应用于黄酒等实际样品中腐败乳酸菌的检测，分别对采用国标方法和优化后的方法对黄酒变质样A或正常样品B进行检测，如表7所示，检测方法优化后，培养4 d后即可计数，连续监测第6天和第8天的菌落数结果，无显著差异；而国标方法培养至第9～10天才能够计数，菌落数与优化的方法接近，同时采用优化的方法对正常的黄酒样进行检测，无菌落生长，排除了假阳性和假阴性的可能。因此该优化的检测方法适用于导致黄酒变质的食果糖乳杆菌的检测，检测时间较国标方法缩短5～7 d。

3 结 论

研究中观测到的黄酒生物性腐败呈浑浊、异味和总酸升高等特点。食果糖乳杆菌是导致黄酒变质的目标腐败菌，该菌在固体培养基上生长缓慢，采用GB 4789.35—2016的方法，需要9～10 d出结果。本实验通过Box-Behnken响应面试验设计对食果糖乳杆菌检测方法进行优化，得到了最优的培养条件为：在MRS固体培养基基础上，L-Cys添加质量分数0.08%，调节pH值为5.4，临用时加入体积分数9%的无水乙醇，培养温度为30 ℃。采用优化后的方法，定量检出时间为3～4 d，缩短一半以上。针对食果糖乳杆菌引起的酸败问题，优化的定量检测条件能够为较快评估该类黄酒腐败程度提供参考。