不同茶树品种悬浮发酵对茶黄素形成的影响

江用文，滑金杰，袁海波，马海乐*

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008）

茶黄素是多酚类（儿茶素类）在酶源和湿热作用下氧化缩合形成的一类溶于乙酸乙酯的、具有苯并卓酚酮结构的化合物，是组成红茶鲜爽度和强度等滋味的重要成分，同时是形成红茶茶汤“黄金圈”的主要物质[1-4]，同时茶黄素具有防癌抗癌、抗菌、抗氧化等多方面的保健价值[5-10]。近年来，随着对茶黄素功能活性的不断探究，学者不仅通过工艺和品种的改良获得高茶黄素的红茶，还通过叶外悬浮/液体发酵获得高茶黄素的提取液。现有有关悬浮发酵对茶黄素形成影响的研究多集中在外源因素，如发酵温度[11-13]、pH值[14]、通氧量[15-16]、时间[17-18]等，夏涛等[13,19-21]较系统地研究了鲜叶匀浆悬浮发酵，明确适度萎凋的鲜叶进行悬浮发酵更有利于茶黄素的生成，获得影响悬浮发酵的关键因子（浓度、pH值等），并得到了优化的悬浮发酵工艺参数。而内源因素，如鲜叶品种、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）酶源组合和配比、儿茶素底物组成和含量、酶源与底物共同作用等，对茶黄素形成能力和形成量影响的研究较少；仅获得表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）与茶黄素的形成具有明显的相关性[22]，PPO和POD对氧化儿茶素具有竞争性[23-24]等初步结果，而酶源活性和组合及儿茶素组分对茶黄素组分形成影响的研究缺乏。为此筛选酶源组成和儿茶素组成配比差异较大的、且实际红茶产区中应用较广泛的福鼎大白、英红9号、槠叶齐、金观音等品种原料进行悬浮发酵实验，探究PPO和POD酶源活性和配比、儿茶素组分（简单儿茶素和酯型儿茶素）配比和浓度等对茶黄素形成能力的影响，为茶黄素的合成理论和茶鲜叶的综合利用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜叶品种及产地：福鼎大白茶 杭州茶叶试验场；槠叶齐 湖南省农业科学院茶叶研究所；英红9号 广东省农业科学院茶叶研究所；金观音 福建省农业科学院茶叶研究所。等级：一芽一叶至一芽二叶初展。采摘时间：2016年5月初。

1.2 仪器与设备

FTE-BTD真空冷冻干燥机 美国Kinetic公司；pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-3600紫外-可见近红外分光光度计、LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；BT 124s分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；5810R台式高速大容量离心机 德国艾本德公司；T18高速分散机 德国IKA集团；PLTW-BA型水浴恒温振荡器 宁波普朗特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样液制备

参照前人的研究[18,25]，分别取100 g预萎凋的福鼎大白、英红9号、槠叶齐、金观音等品种鲜叶，作为不同酶源（PPO、POD等）活性和配比，以及不同儿茶素组分配比的来源，加入1 000 mL浓度0.02 mol/L pH 5.6预冷的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在高速分散机内匀浆1 min，至叶组织粉碎均匀，置于2 000 mL收集瓶内，置于恒温水浴振荡器，调控水浴温度35 ℃、通氧量0.8 L/min、振荡速率150 r/min等参数，开始进行悬浮发酵，分别在发酵0、15、30、45、60、75、90、120 min等时间点进行8 点取样，均匀取样9 mL，加入1 mL饱和柠檬酸终止氧化反应，迅速离心（4 ℃、9 000 r/min离心10 min），过膜待测。

1.3.2 酶活性与成分检测

PPO活性采用邻苯二酚比色法[26]进行测定；POD活性采用愈创木酚比色法[26]进行测定。儿茶素组分和茶黄素组分利用高效液相色谱法[27]进行检测。

1.4 数据处理

每个处理检测结果进行3 次重复，以平 ±s显示。采用SAS 9.1软件进行实验数据分析，处理间平均值的比较用最小显著差异法。

2 结果与分析

2.1 不同品种鲜叶PPO活性、POD活性和PPO活性/POD活性比值的比较

PPO和POD是催化儿茶素组分氧化，转化形成茶黄素、茶红素等物质的关键酶类，但两者催化儿茶素反应的方向不同，且存在竞争性[28-30]。对4 个品种的2 种酶活性进行比较，PPO活性以福鼎大白和金观音品种显著高于其他2 个品种，均达到1.60 U/g以上，英红9号次之，槠叶齐显著最低；POD活性以金观音和槠叶齐品种显著高于其他2 个品种，均达到23.0 U/g以上，英红9号次之，福鼎大白显著最低；综合指标PPO活性/POD活性比值（简写为PPO/POD值）以福鼎大白品种显著最高，达到0.094，英红9号和金观音品种次之，槠叶齐品种显著最小，仅0.042。

表1 不同品种鲜叶PPO和POD活性Table 1 Activities of PPO and POD from fresh leaves of different cultivars

2.2 不同品种鲜叶酶源对悬浮发酵下简单儿茶素组分和总量变化规律的影响

不同品种GC、EGC、儿茶素（catechin，C）、EC等4 种简单儿茶素及其总量在悬浮发酵过程中的变化如图1所示。不同组分在鲜叶的简单儿茶素总量（total simple catechin，TSC）中的占比不同，其中以EGC显著最高（图1B），均值达到0.330 mg/mL（P＜0.05），大幅度高于其他3 组分，EC次之（图1D），GC相对最低（图1A），仅0.056 mg/mL。不同品种茶鲜叶不同TSC组分差异较大，其中EGC、C和EC组分以英红9号最高，GC以金观音品种最高，槠叶齐品种则在GC和EGC组分最低，不足英红9号品种的50%。

悬浮发酵过程中，除金观音和福鼎大白的C组分在悬浮发酵前15 min略有增加（图1C），分析原因在于酯型儿茶素转化形成茶黄素的同时裂解形成小分子的C组分所致；其他品种的其他组分均不同程度地下降，且均在前30 min呈现大幅度减少，减少量均在75%以上，即发酵前30 min简单儿茶素组分呈现剧烈的酶促氧化反应，至发酵45 min，消耗量达90.0%以上，简单儿茶素组分所剩无几，4 种组分均在0.010 mg/mL以下。

图1E为不同品种的TSC在悬浮发酵下的变化规律。从鲜叶来看，英红9号的TSC显著最高（P＜0.05），达0.809 mg/mL，金观音略高于福鼎大白，槠叶齐最低，仅0.533 mg/mL；TSC前45 min呈匀速大幅度下降的趋势，总消耗量以英红9号最大，达0.783 mg/mL，显著高于（P＜0.05）其他3 品种鲜叶，金观音次之，福鼎大白显著最低，仅0.520 mg/mL。45 min后，各品种TSC均在0.035 mg/mL以下，含量趋于平稳。即不同品种间，以英红9号的TSC消耗量最大，金观音次之，槠叶齐最低。

图1 不同品种鲜叶悬浮发酵过程中4 种简单儿茶素组分含量的变化Fig. 1 Variations in 4 simple catechins during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

2.3 不同品种鲜叶酶源对悬浮发酵下酯型儿茶素组分和总量变化规律的影响

不同品种EGCG、GCG、ECG、CG等4 种酯型儿茶素组分悬浮发酵过程中的变化规律如图2所示。4 组分在茶鲜叶中酯型儿茶素总量（total ester-type catechin，TETC）的占比不同，以EGCG相对最高，均值达到0.531 mg/mL（图2A），显著高于（P＜0.05）其他3 个组分总和（0.245 mg/mL），ECG次之，CG相对最低，仅0.005 mg/mL（图2D）。不同品种茶鲜叶的不同TETC差异显著，如EGCG、ECG和CG组分以英红9号显著最高（P＜0.05），以槠叶齐显著最低，而GCG组分则以槠叶齐品种最高，英红9号最低。

不同TETC在悬浮发酵中变化规律不同，其中EGCG和ECG组分呈前45 min迅速消耗（图2A和图2C）而后平稳的趋势，前30 min消耗量最大，达70%以上，至45 min，各品种EGCG质量浓度均在0.05 mg/mL以下，ECG质量浓度均在0.015 mg/mL以下，消耗量在90%以上；不同品种比较，福鼎大白和金观音的EGCG和ECG消耗量显著大于英红9号和槠叶齐品种，前2 个品种的EGCG组分在发酵30 min时质量浓度在0.04 mg/mL以下，而英红9号和槠叶齐EGCG保留量均高于0.10 mg/mL。GCG组分除槠叶齐呈逐渐下降的趋势，其他3 品种呈先升后降的趋势，峰值点出现在15～30 min，以金观音增长相对最多，后迅速消耗；CG组分总体呈前期略有上升后期平稳的趋势，其中以英红9号显著最高（P＜0.05），槠叶齐次之，福鼎大白相对最低。

图2 不同品种鲜叶悬浮发酵过程中4 种酯型儿茶素组分的变化Fig. 2 Variations in 4 catechin esters during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

图2E是不同品种的TETC在悬浮发酵过程中的变化，从鲜叶来看，英红9号显著最高（P＜0.05），达0.872 mg/mL，福鼎大白略高于金观音，槠叶齐最低，仅0.697 mg/mL。整个发酵进程中前30 min TETC消耗最快，不同品种相比以英红9号和槠叶齐仍有部分保留（保留量0.190 mg/mL以上），这与较低活性的PPO相关，而具有高PPO活性的福鼎大白和金观音品种在发酵30 min后TETC均低于0.080 mg/mL，氧化消耗率均在90.0%以上。而后在发酵45 min后缓慢趋于稳定，各品种TETC差异不显著。整体上，以英红9号的TETC消耗量最大，达0.842 mg/mL，金观音次之，槠叶齐相对最低，仅0.650 mg/mL。

图3 不同品种鲜叶悬浮发酵过程中TAC的变化Fig. 3 Variations in total amount of catechins during suspended fermentation during fresh leaves of different cultivars

悬浮发酵过程中不同品种8 种儿茶素总量（total amount of catechins，TAC）的变化规律如图3所示。以英红9号鲜叶TAC显著最高（P＜0.05），达1.680 mg/mL，金观音和福鼎大白次之，两者相差不大，但以福鼎大白品种的TETC相对较高，金观音品种的TSC相对较高，槠叶齐相对最低，仅1.230 mg/mL。4 个品种TAC整体呈前30 min迅速下降的趋势，平均下降速率以金观音最大，达0.042 mg/（mL·min），福鼎大白次之，槠叶齐显著最低，仅0.030 mg/（mL·min）。发酵30～45 min间TAC在PPO和POD作用下进一步消耗，降至在0.095 mg/mL以下，45 min后含量趋于平稳。整体上，以英红9号的TAC消耗量最大，达1.639 mg/mL，金观音次之，槠叶齐相对最低，仅1.192 mg/mL。

2.4 不同品种鲜叶酶源和底物对悬浮发酵下茶黄素组分及总量形成规律的影响

不同品种的茶黄素（theaflavin，TF）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin 3-gallate，TF-3-G）、茶黄素-3’-没食子酸酯（theaflavin 3’-gallate，TF-3’-G）、茶黄素双没食子酸酯（theaflavin 3,3’-digallate，TF-D-G）4 种茶黄素组分在悬浮发酵过程中的生成变化规律如图4所示。不同品种各茶黄素组分均随着发酵时间延长呈现先增后降的趋势，然而不同品种茶黄素组分峰值点出现的时间不同，英红9号和槠叶齐在发酵30 min达到峰值，而福鼎大白和金观音品种的PPO活性显著较高（表1），故可以较快将儿茶素组分转化形成茶黄素，在发酵15 min即达到峰值，而后随着儿茶素组分消耗过快，茶黄素各组分含量逐渐下降。不同品种不同茶黄素组分的峰值差异显著，TF组分（图4A）以英红9号显著最高（P＜0.05），达0.089 mg/mL，金观音次之（0.046 mg/mL），槠叶齐最低，仅0.022 mg/mL；TF-3-G组分含量在发酵15min时呈福鼎大白＞金观音＞英红9号＞槠叶齐（图4B）趋势，原因在于发酵15 min时TF-3-G组分的合成前体EGCG组分以福鼎大白品种消耗量最大（图2A），在高PPO活性催化下达0.290 mg/mL，金观音次之（0.244 mg/mL），槠叶齐显著最低（P＜0.05），仅0.127 mg/mL，然进一步发酵金观音和福鼎大白品种TF-3-G组分的转化量大于生成量开始下降，而英红9号和槠叶齐品种儿茶素在低活性PPO作用下持续氧化转化，加上具有较高含量的底物（图2A），故峰值高于福鼎大白品种，且TF-3-G峰值英红9号品种大于槠叶齐品种；TF-3’-G组分峰值点呈现英红9号＞金观音＞槠叶齐＞福鼎大白的特点。TF-D-G组分峰值以福鼎大白品种显著最高，英红9号品种底物更多地用于TF-3-G组分的形成，故TF-D-G组分峰值低于福鼎大白品种，然而高组分的儿茶素底物保证了英红9号品种的4 个茶黄素组分在30 min以后的发酵时间里均显著高于其他3 个品种，而槠叶齐品种虽儿茶素底物含量较低，但PPO和POD活性亦较低，故茶黄素组分转化成茶红素、茶褐素等能力差，故在TF、TF-3-G、TF-D-G等组分含量在发酵60 min以后高于金观音和福鼎大白品种。

图4 不同品种鲜叶悬浮发酵过程中4 种茶黄素组分含量和总量的变化Fig. 4 Variations in the contents of four theaf l avins during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

不同品种4种茶黄素总量随着发酵时间的变化规律如图4E所示。因高活性PPO、发酵前15 min较高消耗量的EGC、EGCG、ECG等组分，导致金观音和福鼎大白品种在发酵15 min时茶黄素总量出现峰值，且金观音品种略高于英红9号品种。而较低活性的PPO和POD（表1）可持续氧化最高儿茶素底物含量的英红9号品种，可实现茶黄素的持续生成，在30 min达到峰值，为0.226 mg/mL，极显著高于其他品种（P＜0.01），并且直至120 min发酵结束，仍显著最高（P＜0.05）。槠叶齐品种则因相对最低活性的PPO（1.004 U/g），以及相对最低含量的儿茶素底物（图3），茶黄素总量峰值显著最低，然而较低活性的POD可减少TFS的再转化，故发酵60 min后槠叶齐茶黄素总量略高于福鼎大白和金观音品种。

从总体上看，不同茶树品种，对应的儿茶素底物浓度和组分比例以及酶源活性和配比显著不同，进而直接影响茶黄素的生成速率和生成量，具有显著最高TAC的英红9号品种可产生显著最多的茶黄素（P＜0.05）；福鼎大白和金观音品种的TAC相近，然而组成不同，其中以福鼎大白TETC/TSC相对较高，且PPO/POD值显著高于金观音品种（P＜0.05），故福鼎大白品种可产生第2高的茶黄素，但TAC显著低于英红9号，故茶黄素形成能力略差于英红9号，而TAC含量和PPO/POD值显著最低的槠叶齐品种，茶黄素的形成速率和形成量显著最低（P＜0.05）。

3 结 论

4 个品种鲜叶PPO活性、POD活性、PPO/POD值差异显著，其中PPO活性以福鼎大白品种显著最高，以槠叶齐品种显著最低；POD活性以槠叶齐品种最高，福鼎大白品种显著最低；PPO/POD值以福鼎大白最高，英红9号次之。

不同品种的简单儿茶素组分以EGC含量最高，EC次之；酯型儿茶素组分以EGCG含量最高，ECG次之；酯型儿茶素的鲜叶原始量和氧化消耗量均大于简单儿茶素，TSC和TETC均以英红9号显著最高，槠叶齐显著最低；儿茶素各组分除GCG和CG外均呈前期剧烈消耗下降，后期平稳的趋势，巨降期均在发酵前30 min。

不同品种的不同茶黄素组分形成能力和形成量差异显著，各茶黄素组分均呈先升后降的趋势，但峰值点时间和峰高不同，其中英红9号和槠叶齐各茶黄素总量组分峰值点均为发酵30 min，福鼎大白和金观音品种则为15 min，茶黄素总量以英红9号最大，福鼎大白和金观音次之，槠叶齐显著最低。

PPO/POD值和儿茶素含量及配比两者对茶黄素的形成具有同等关键作用，高儿茶素底物含量的同时，需配有对应高PPO活性和PPO/POD值，才能快速高效地形成茶黄素，同时减少茶黄素的进一步转化，保持高茶黄素的形成，同等儿茶素含量以TETC/TSC值较高者，即酯型儿茶素含量较高，更有利于茶黄素的形成。