尿毒症血液透析患者中性粒细胞胞外诱捕网水平与冠状动脉疾病的关系

刘娜娜 姜 文

终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)患者死亡风险较高，大约是一般人群的十倍[1]。越来越多的证据表明，ESRD患者死亡主要源于心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)和感染并发症所造成的机体免疫功能紊乱[2-3]。而尿毒症毒素和细胞因子滞留被认为是诱导氧化应激和炎症的免疫功能障碍的关键因素，使患者更容易感染与动脉粥样硬化。有研究指出，尽管在ESRD患者中活化的中性粒细胞数量增加，但杀菌能力却显著降低，提示或许与中性粒细胞功能障碍有关[4]。相反，尿毒症状态的过度激活和凋亡增加会导致低度炎症、内皮功能障碍和动脉粥样硬化。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是一种新发现的细胞死亡程序，可从死亡的中性粒细胞中释放捕杀病原体，是由核酸物质和颗粒蛋白组成的网状结构。已有研究证实，NETs具有促凝、抗凝、抗炎及加重血管内皮功能障碍等作用[5]。尿毒症患者中冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)的发生与炎症反应、血液高凝状态等因素有关[6]。因此，早期检测尿毒症患者中NETs可能对CAD疾病的预防和治疗有重要意义。本研究通过探讨尿毒症血液透析患者中NETs水平与CAD的关系，为CAD疾病的防治提供临床循证医学证据。

资料与方法

1.研究对象 选择2010年1月至2015年12月,来我院接受血液透析的尿毒症患者96例。根据64层螺旋CT检查结果将患者分为无CAD发生组(n=60)和CAD发生组(n=36)。其中，无CAD发生组男性35例，女性25例；年龄39～79岁，平均(60.05±10.86)岁。CAD发生组男性20例，女性16例；年龄42～83岁，平均(65.04±11.25)岁。本研究获得我院医学伦理学委员会批准，且所有研究对象均知情同意。

2.纳入和排除标准 (1)纳入标准：临床明确诊断为尿毒症的长期规律血液透析；64层螺旋CT(冠状动脉CTA)检查确诊为CAD；检查资料完整；由直系亲属知情同意并签署知情同意书，提供患者的详细资料。(2)排除标准：既往有CAD发生史(不稳定型心绞痛、稳定型心绞痛、心肌梗死、冠心病)；伴有心、肝、脾、肺等重要脏器损伤；其他中枢神经系统疾病以及自身免疫系统疾病；恶性肿瘤；未签署治疗知情同意书。

3.研究方法 抽取患者外周静脉血5 mL，3 000r/min离心10 min,取上清，置-70℃低温冰箱保存。血浆复温后取100μL，加入PicoGreen荧光染料避光孵育10～20min，应用荧光酶标仪检测样品荧光值，再根据标准曲线计算样品NETs水平。详细询问、检测并记录所有入组患者的临床资料，包括性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、嗜酒史、糖尿病史、高血压史、高血脂史、透析龄、收缩压、舒张压、心率等指标。抽取患者清晨空腹静脉血2～10mL，应用深圳雷杜公司 RT7200全自动血液分析仪和日本奥林巴斯公司AU2700型全自动生化分析仪检测各生化指标，包括白细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白、尿素氮、血肌酐、白蛋白、尿酸、总胆固醇、C反应蛋白、血磷、血浆钙、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)等。冠状动脉钙化积分(coronary artery calcification score，CACS)采用Agatston等及其修正方法计算[7]，钙化积分=钙化灶CT峰值×钙化面积，钙化灶条件为钙化面积>1mm2、CT值>130 Hu。其中，130～200Hu记为1分，200～300Hu记为2分，300～400Hu记为3分，≥400 Hu记为4分。钙化总积分包括各主要分支(左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉)钙化灶积分的总和，该过程由智能积分软件计算完成。

4.统计学分析 所有数据均利用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。NETs水平与其他临床指标的相关性采用Pearson相关性分析。尿毒症患者各传统因素和非传统因素与CAD的关系采用单因素、多因素非条件Logistic回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.两组患者临床资料比较 两组患者在年龄、有糖尿病史、白细胞计数、中性粒细胞计数、尿素氮、血肌酐、总胆固醇、C反应蛋白、NETs、透析龄、血磷、钙磷乘积、收缩压、PTH、CACS方面差异显著(P<0.05)，在性别、BMI、有吸烟史、有嗜酒史、有高血压史、有高血脂史、血红蛋白、白蛋白、尿酸、血浆钙、舒张压方面，差异无统计学意义(P>0.05)。其中，CAD发生组在年龄、有糖尿病史例数、白细胞计数、中性粒细胞计数、尿素氮、血肌酐、TC、C反应蛋白、NETs、透析龄、血磷、钙磷乘积、收缩压、PTH、CACS方面显著高于无CAD发生组(P<0.05，表1)。

表1 两组患者临床资料比较

注：1mmHg=0.133kPa

表2 尿毒症患者各临床因素与CAD关系的Lagistic分析结果

2.尿毒症患者各临床因素与CAD的关系 单因素Logistic回归分析结果显示，年龄、有糖尿病史、白细胞计数、中性粒细胞计数、尿素氮、血肌酐、总胆固醇、C反应蛋白、NETs、透析龄、血磷、钙磷乘积、收缩压、PTH、CACS与CAD发生密切相关(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示，年龄、有糖尿病史、白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白、NETs、透析龄、CACS与CAD发生密切相关(P<0.05，表2)。

3.尿毒症血液透析患者NETs水平与其他临床指标的相关性 相关性分析结果显示，NETs水平与年龄、白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白、透析龄、CACS呈正相关(P<0.05，表3)。

表3 尿毒症血液透析患者NETs水平与其他临床指标的相关性分析结果

讨 论

巨噬细胞通常被认为是参与动脉粥样硬化发病机制的主要免疫细胞。然而，中性粒细胞作为第一个对组织损伤作出反应的细胞，其作用越来越受到人们的重视。中性粒细胞主要参与动脉粥样硬化的早期阶段，并促进单核细胞和巨噬细胞等炎症细胞的分泌[8]。事实上，NETs与中性粒细胞一样，同样在小鼠和人的动脉粥样硬化病变管腔、急性心肌梗死患者的新鲜溶解的血栓标本中被发现[9]。NETs是中性粒细胞活化时释放的网状物质，具有抗炎、促炎、促凝等多种生物活性，并参与多种疾病的病理进程。Warnatsch等[10]的研究指出总胆固醇结晶可触发中性粒细胞释放NETs，这些NETs可促使巨噬细胞释放细胞因子，激活T细胞，并增强在动脉粥样硬化斑块中免疫细胞的招募。此外，Warnatsch等的研究还指出NETs可作为引发血管炎症的内源性毒素。还有研究发现，NETs含有的细胞外DNA具有血栓形成效应，并且能够与巨噬细胞产生交互作用，作为将炎症和血栓形成联系起来的桥梁，在动脉粥样硬化的病理进程中发挥重要作用[11]。

事实上，与尿毒症相关的免疫细胞功能紊乱已经确定为病毒相关癌症、感染和肾功能不全患者的危险因素[12]。动脉粥样硬化和血管并发症的风险增加也可能与尿毒症相关的免疫功能紊乱和炎症反应有关。中性粒细胞活化可产生丰富的内源性毒素NETs和氧化应激反应，然而，NETs水平与CAD发生关系的研究报道较少。张芳晓等[13]的研究指出，脓毒症患者NETs水平显著升高，可作为早期诊断脓毒症的生物标志物。于芹等通过探讨NETs在尿毒症急性冠状动脉综合征中的作用，发现尿毒症组较健康对照组中NETs水平显著升高，其水平与血小板呈负相关，在尿毒症急性冠状动脉综合征患者中检测意义巨大[14]。陈本露等[15]通过探讨NETs在类风湿关节炎患者中可能存在的作用，发现中性粒细胞可能通过网捕死亡形成NETs，NETs水平可能与类风湿关节炎疾病的活动程度有关。本研究发现，NETs水平与年龄、白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白、透析龄、CACS呈正相关，并指出NETs水平与CAD发生密切相关。尿毒症血液透析患者中NETs促进CAD发生的机制可能涉及血浆树突细胞的自体免疫激活[16]。从机制上来讲，NETs中的DNA和从死亡细胞中释放的DNA复合物与中性粒细胞产生的颗粒蛋白能够刺激血管壁中的血浆树突细胞活化并产生强烈的I型干扰素反应，从而导致CAD发生。此外，NETs中的自体DNA成分可以刺激机体自体免疫激活和双链DNA抗体形成，从而促进动脉壁炎症反应及动脉粥样硬化病变的形成及CAD发生。NETs水平与白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白呈负相关，表明NETs所发挥的促炎生物学作用较强。NETs中含有的循环游离DNA成分可以作为免疫原而激活免疫应答，进而放大机体的免疫反应，发挥促炎作用[17]。本研究与Kim等研究结果类似，均表明尿毒症血液透析患者NETs水平与CAD发生密切相关[18]。

本研究存在一定局限性：本研究由于是横断设计，不能确定NETs水平与CAD发生的因果关系；样本量较少制约本研究结论的全面性；纳入的患者可能未排除其他未知影响因素，对结论也会造成影响。总之，尿毒症血液透析患者中NETs在导致CAD发生的确切机制及其信号通路方面还需更深入更细致的研究，但NETs水平与CAD发生密切相关，可作为预测CAD发生的危险性因素。