秸秆还田与高温闷棚对设施连作土壤微生境及番茄生长发育的影响

何志刚，娄春荣，董 环，王秀娟，赵 颖，韩瑛祚

(辽宁省农业科学院 植物营养与环境资源研究所，辽宁 沈阳 110161)

设施农业的发展逐渐改变了土壤原有的生态环境，导致光照、湿度、温度等发生了较大的变化，使设施土壤经常处于高温、高湿、无雨水淋溶的环境中。与此同时，生产中盲目追求高产，采取高施肥、高用药等管理措施，也使设施土壤发生了很大的变化[1]。其中，设施土壤连作障碍等问题已成了设施农业持续高效生产的瓶颈[2-4]。

国内外研究表明，目前解决设施土壤连作障碍主要依靠化学防治措施，但其毒性高、残留多，且防效不稳定。高温闷棚技术是防效较为稳定的物理防治措施之一，一般在每年夏季6—7月，以塑料薄膜封闭日光温室，利用光照提高温室内温度，从而有效杀灭温室中的有害病原菌及部分害虫[5-8]。

1 材料和方法

1.1 试验地点和材料

试验地点设在铁岭新台子镇诸民屯某农户的日光温室。试验地耕层土壤为草甸土，壤土，速效氮154.3 mg/kg、速效钾142.97 mg/kg、速效磷 120.26 mg/kg，电导率(EC)730 μS/cm，pH值6.03，有机质6.8 g/kg，容重1.35 g/cm3。供试番茄品种为朗婷。

1.2 试验方法

试验共设3个处理，即CK：高温闷棚(干闷，不淹水)，为当地生产的习惯模式；T1：高温闷棚(湿闷，淹透水)；T2：高温闷棚+玉米秸秆(湿闷，淹透水)，该处理将30 000 kg/hm2玉米秸秆粉碎后利用旋耕机翻入0～30 cm土壤中，然后灌透水。每处理 3次重复，小区面积25 m2，随机排列。以上处理于2015年6月25日进行。各处理均施加牛粪75 m3/hm2，利用旋耕机翻入0～30 cm土壤中，然后浇水、覆地膜、封棚，高温闷棚 25 d。闷棚结束采集土样，每个小区3次重复，每个处理分别采集9个样点混合均匀，用于土壤理化性质的测定，并留部分样品装入密封袋内，放入冰盒中带回实验室，用于分析微生物方面的指标。起垄种植番茄，种植密度同当地生产的习惯模式。2015年9月28日种植，2016年6月5日收获。管理措施同常规大棚。于番茄关键生育时期测定相关指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 微生物种群测定 采用土壤DNA提取试剂盒(Power Soil DNA Isolation Kit，深圳市安必胜科技有限公司)提取土壤微生物总DNA，其纯度和浓度用核酸定量仪(ND-1000，美国Nano 公司)检测。DNA样品纯化后送至北京百迈客公司应用Illumina平台的HiSeq进行测序，方法见参考文献[12-13]。

1.3.2 理化性质测定 测定高温闷棚后土壤的EC值、pH值、有机质含量，方法见参考文献[14]。

1.3.3 生理指标测定 每小区随机选取10株健康番茄，测定株高，标记功能叶，测定主茎倒3叶叶绿素含量(SPAD值)。于晴朗天气10:00—14:00使用LI-6400XT光合仪测定番茄主要生育时期(苗期)功能叶净光合速率(Pn)及胞间二氧化碳浓度(Ci)。

1.3.4 番茄产量测定 2016年1月开始采收番茄，每10 d采收1次，至2016年5月止。收获期间记录果实鲜质量。

1.4 数据分析

根据1.3.1微生物种群测定中测序结果的Barcode序列等，从下机数据中拆分出各样品数据，使用FLASH软件对每个样品的数据进行拼接，得到高通量测序原始数据。去除嵌合体、两端引物以及非靶区域序列后得到有效数据，按照97%的序列相似度分为多个操作分类单元(OTU)；用综合考虑物种多样性及丰度的weighted unifrac法进行UPGMA聚类分析；使用UniFrac软件中的Jackkifed算法进行样本之间的距离计算，用SPSS 20.0 将土壤环境因子数据进行统计分析，得出3 次重复的均值，作土壤环境因子矩。主成分分析、冗余分析(Redundancy analysis,RDA)利用多元统计分析软件CANOCO进行，提取主要的环境因子；将土壤细菌高通量测序得出的土壤细菌丰度指数、多样性指数作土壤细菌矩阵。分析结果使用CANOCO软件制图。其余常规数据采用Excel 2007、SPSS 19.0软件进行处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理番茄植株生理指标及产量变化

不同处理间番茄植株SPAD值表现为T2>T1>CK，T1与T2差异不显著，其与CK差异均达到显著水平(表1)；株高表现为T2>T1>CK，T1与CK差异不显著，T2与T1、CK差异均达到显著水平；Pn表现为T2>T1>CK，T1与T2差异不显著，与CK差异均达到显著水平；Ci表现为T2>T1>CK，T1与CK之间差异不显著，T2与T1、CK差异均达到显著水平；产量表现为T2>T1>CK，T1与T2差异显著，且均与CK差异达到显著水平。其中T1与CK 相比，产量增加19.89%，T2与CK 相比，产量增加38.99%。上述结果表明，改变当地生产的习惯模式[高温闷棚(干闷，不淹水)]，由干闷(不淹水)改为湿闷(淹透水)更利于提高产量，改善作物生理指标，在湿闷的基础上添加玉米秸秆则效果更佳。

表1 不同处理番茄植株生理指标及产量

注：同列不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 不同处理土壤细菌群落变化

不同处理土壤细菌16S rRNA高通量测序结果(表2)表明，16S rRNA有效序列数平均达到53 893.83条，有效序列数比例在94%以上。不同处理有效序列数表现为CK>T1>T2，处理间差异显著。从微生物分类水平观察，不同处理的OTU数表现为CK>T1>T2，不同处理界、门、纲3个分类水平上OTU数差异均不显著，目、科、属、种与上述3个分类水平相比，总体数量有所下降，但处理间差异仍不显著。CK土壤中有效序列数、OTU数均高于T1、T2，表明湿闷对土壤中细菌的杀菌效果高于干闷，尤以添加玉米秸秆的处理T2杀菌效果为最佳。

表2 不同处理土壤细菌16S rRNA高通量序列数及OTU数

由不同处理土壤优势细菌维恩图(图1)可知，3个处理土壤细菌优势属(相对丰度>1%)一共有1 255个，3个处理土壤共有的优势属为1 171个；处理T2优势属种类最多，达到1 237个；CK优势属种类最少，为1 205个；处理T1优势属种类为1 229个。

图1 不同处理土壤优势细菌维恩图

3个处理土壤共有的相对丰度较高的前11位优势菌属(表3)中，芽孢杆菌(Bacillus)、硫杆菌(Thiobacillus)、拟杆菌(Bacteriobacterium)是主要的优势菌株。其他的优势菌属相对丰度从多到少依次为氯代苹果酸杆菌(Chlorobacterium)、嗜酸杆菌(Acidophilus)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)、α-变形杆菌(α-proteobacteria)、嗜热厌氧杆菌(Thermophilicanaerobe)、假单胞菌(Pseudomonas)、丝孢菌(Scedosporium)。芽孢杆菌在3个样品中的OTU数表现为CK>T1>T2。芽孢杆菌在高温下不易被杀灭，因此在3个处理中均是优势菌群之一；与芽孢杆菌相反，拟杆菌在3个样品中表现为T2>T1>CK，且T2中该菌种数量明显高于其他2个处理，可能是添加秸秆会刺激该类菌株生长；丝孢菌多为土传病害致病菌，在3个样品中表现为CK>T1>T2，说明干闷对土壤中土传病害致病菌杀菌效果低于湿闷。

表3 不同处理土壤相对丰度前11位优势菌属的OTU数 个

基于Beta多样性分析，得到的不同处理UPGMA聚类结果见图2。样品越靠近，支越短，代表2个样品物种组成越相似。T1、T2的土壤微生物群落聚为一个类群，CK土壤微生物群落为一个类群，表明是否淹水是影响土壤微生物群落划分的主要因素。

图2 不同处理土壤微生物群落UPGMA聚类结果

2.3 不同处理土壤环境因子变化及其与微生物群落关联分析

不同处理土壤理化性质见表4。处理不同，土壤理化性质明显不同。其中，T1、T2有机质含量显著高于CK。土壤EC值是研究土壤中水溶性离子含量的重要指标，T1、T2土壤EC值均明显低于CK，且与CK差异达到显著水平，说明湿闷可以显著降低土壤中的盐分含量。添加玉米秸秆土壤EC值与T1相比略有下降，但差异不显著。分析其原因，可能是玉米秸秆腐解，增加了土壤有机胶体、腐殖质的量，增强了土壤胶体对水溶性离子的吸附能力，降低了土壤中水溶性离子活性，进而降低了土壤中水溶性盐分含量[15]。总体来看，湿闷+玉米秸秆既可以明显增加土壤有机质含量，又可以降低土壤盐分含量，培肥地力的同时，还可以改良土壤次生盐渍化状况。T2的pH值低于另外2个处理，但处理之间差异未达到显著水平。添加秸秆结合湿闷可以产生有机酸[16]，这可能是导致土壤pH值下降的主要原因。

表4 不同处理土壤理化性质

不同处理土壤优势细菌环境因子RDA图(图3)表明，3个环境因子主要可以集中为2类：在第4象限存在1个环境因子SOM(土壤有机质)，在第2象限存在2个环境因子pH值、EC值，为正相关关系，并与第4象限的环境因子SOM负相关。主要环境因子对土壤微生物群落的影响方面，3个环境因子主要集中为2类，第4象限环境因子SOM主要影响的微生物群落为芽单胞菌目；第2象限环境因子pH值、EC值主要影响的微生物群落为鞘脂单胞菌目、黄色单胞菌目。

CK1、CK2为CK的土壤样品；T11、T12为

3 结论与讨论

近年来，随着设施园艺栽培面积的扩大，其产值逐渐居种植业首位。由于设施农业具有高集约化程度、高复种指数、轮作困难等特点，导致随着栽培年限的增加，病虫害发生日益严重，连作障碍问题尤其突出，常常造成严重减产甚至绝收[17]。胡俏强等[7]研究表明，灌水高温闷棚的处理，植株在株高、茎粗、叶片生长以及果实品质等方面都优于对照。本试验中，高温闷棚+玉米秸秆(湿闷，淹透水)处理的株高、SPAD值、Pn、Ci明显高于另外2个处理，产量比当地习惯模式(CK)增产38.99%，表明在高温闷棚(湿闷，淹透水)的基础上添加玉米秸秆，可以优化高温闷棚的效果。

土壤微生物是土壤微生态环境中活性最强的部分，是衡量土壤生态环境质量的重要指标。李佳川等[11]研究表明，灌水高温闷棚处理后土壤微生物区系表现为细菌、放线菌含量升高，真菌含量降低。由于灌水及高温作用，使微生物土壤由“真菌型”土壤转化为“细菌型”土壤。本研究结果表明，3个处理土壤的16S rRNA有效序列数平均达到53 893.83条，基因片段覆盖在94%以上。处理间土壤16S rRNA有效序列数差异显著，其中，CK的16S rRNA有效序列数最多；聚类分析显示，T1、T2的土壤微生物群落聚为一个类群，CK土壤微生物群落为一个类群，说明是否淹水是影响土壤微生物群落划分的主要因素；3个处理土壤样品共有的相对丰度较高的优势菌属为：芽孢杆菌、硫杆菌、拟杆菌。在当地生产习惯模式的基础上进行改进优化组合后，湿闷可以明显增强杀菌消毒效果，添加玉米秸秆后整体效果更优，这与刘亮亮等[18]的研究结论一致。

微生物菌群结构和数量与土壤理化数据具有一定相关性[16]。本研究结果表明，3个处理的有机质含量、pH值、EC值呈现不同变化，T1、T2的EC值均显著低于CK，表明湿闷可以显著降低土壤中的盐分含量，添加玉米秸秆后土壤EC值与不添加秸秆的T1相比略有下降，但差异不显著，表明淹水是降低土壤EC值的主要因素，这与李佳川等[11]的研究结果一致；T2土壤有机质明显高于其余2个处理，说明添加玉米秸秆可以明显增加土壤有机质，起到培肥地力的作用；环境因子SOM与pH值、EC值负相关，SOM主要影响的微生物群落为芽单胞菌目；环境因子pH值、EC值正相关，主要影响的微生物群落为鞘脂单胞菌目、黄色单胞菌目。综上所述，添加玉米秸秆结合高温闷棚(湿闷，淹透水)，不仅对土壤具有强的消毒作用，还能加速秸秆分解，提高土壤有机质含量，降低土壤盐分含量，改善土壤微生态环境。但对该技术在病原真菌灭菌过程中产生的有机酸、气体的机制尚未完全了解[18-20]，后续需进一步研究。