环境监测生物实验室底栖动物标本库建设

张 翔, 于 璐, 徐东炯, 顾娟娜, 吴礼裕

(1. 常州市环境监测中心, 江苏 常州 213001； 2. 常州市人居环境检测防治中心, 江苏 常州 213001)

0 引 言

底栖动物是水生态系统的重要组成[1]，对其监测现已成为水环境生物监测的重要部分[2]，是江苏省政府率先批复实施的《江苏省太湖流域水生态环境功能区划(试行)》[3]中是水生态健康指数的重要组成，直接关系到太湖流域水生态管理目标。

底栖动物标本库是环境监测实验室底栖动物的监测和研究的基础，其完善程度直接影响到底栖动物分类鉴定的准确性和可信性，是实验室不可或缺的一部分。针对生物多样性研究，国内各大高校及科研院所会依据研究方向和内容建设其标本库，但大多集中在植物、鱼类、兽类、禽类和鸟类等，专门建设针对底栖动物的标本库以海洋底栖动物为主，淡水极少涉及，且无完善的管理规则。这使得国内拥有底栖动物标本库的单位无法正常交流标本，也无法提升底栖动物的研究水平。本文致力于底栖动物标本库建设的步骤和质量控制研究，覆盖实验室管理中对人员、器材、物料、环节、方法的规定，相关实验室可直接将其用作底栖动物标本库建设与管理的规范参考文件。

1 底栖动物标本库建设目的和现状

对于底栖动物标本的分类鉴定，主要依靠科研院所和环境监测系统的论文、书籍，现虽已是彩色图片与个体特征介绍的图文并茂形式，但其浸制标本库的建设依然不健全，“一个标本胜千言”[4]，这不仅涉及生物监测、科研工作，更是对环境管理、环境保护的准确性、科学性、推广性有重要现实意义。

底栖动物标本库构成主要为浸制标本，部分为干制标本和玻片标本，其建设是生物监测应用于环境管理的支撑，也是底栖动物监测标准化、系统化、QA/QC的一部分，在科研、监测中占有重要地位。在国外主要依托博物馆对标本进行收集和管理。欧美的大型自然历史博物馆均已将标本视为世界文化遗产，只要出于科研需要，任何国家和地区的人员均有权使用，而且一般都得到博物馆的支持和帮助。但在国内博物馆的标本主要以保存为主，许多标本都难以借出[5]。

2 底栖动物标本库的建设

2.1 标本获取与固定

野外采集底质，为获得小型个体和早期生命阶段的各种底栖无脊椎动物使用60目标准筛洗净样品[6]，仅为获得大型底栖无脊椎动物使用40目标准筛洗净样品，经专业知识人员挑拣其中的底栖动物装入样本瓶(PET、PP材质)，用80%乙醇溶液初步固定，固定液分多次加入并晃动样本瓶，保证标本从麻醉到固定，否则将因剧烈脱水导致标本破坏，固定后液面必须没过标本最高处1倍。当挑拣中存在大个体软体动物时，需单独存放，最好以10%福尔马林(4%甲醛)溶液固定，固定液面没过标本最高处；如加入80%乙醇溶液固定，则固定后液面必须没过标本最高处1倍。

75%乙醇溶液因其渗透性强和吸收蛋白质水分的原因，使得生物细胞脱水变性达到杀菌目的，进而保存标本；10%福尔马林(4%甲醛)溶液因能很快与蛋白质反应变性达到杀菌目的，同时将蛋白质转换为可阻止标本腐烂的不溶性树脂，进而保存标本[7]。但两者在使用中，由于标本挑拣时不可避免地带入少量水分和生物个体含水率高的原因，使得固定液浓度在加入时就会下降，而受两种固定液固定标本原理的不同，初次添加的固定液以80%乙醇溶液和10%福尔马林(4%甲醛)溶液为宜。在配置固定液前必须检视乙醇原液和甲醛原液，原液纯度达工业级以上，但液体必须清澈透亮，不能存在沉淀或杂质。特别是甲醛原液，高浓度甲醛原液在低温下会形成乳白色固体沉淀，剩下溶液实际为含甲醛极少的水[8]，万不可弃去沉淀后做原液使用。配置固定液所使用的水干净清澈，不苛求去离子水或纯净水。配置好的乙醇溶液易挥发，甲醛溶液对人体有害，均需密封保藏且尽快使用。

如标本需进行DNA条形码识别时，需以无水乙醇(分析纯及以上)保存，使用5 ℃已冷却24 h以上的无水乙醇保存最佳，可提取含杂质较少的DNA。

2.2 标本初步筛选

在标本固定后1～3 d由分类人员将标本进行初步筛选，剔除挑拣时带出的杂质，将大小差异较大的标本分开存放，并置换同浓度的新固定液。在筛选过程中对颜色不同的底栖动物予以记录，可文字记录或直接拍照留存。需进行DNA条形码识别的标本，初次置换下的无水乙醇保存液需置于5 ℃低温并做好记录。

2.3 标本分类鉴定

由受训后的形态学分类人员对获得的标本进行形态学分类鉴定，需参考现有已发表的文字、图片、影像资料和自然历史博物馆的馆藏凭证标本，分类完成时按各自的门、纲、目、科、属、种进行归类，尽可能分类至属、种级别，但必须保证准确有依据，单个结果由分析人员、审核人员共同作出。淡水底栖动物主要包括软体动物门(Mollusca)、环节动物门(Annelida)、节肢动物门(Arthropoda)、扁形动物门(Platyhelminthes)、线形动物门(Nematomorpha)、线虫动物门(Nematoda)、纽形动物门(Nemertea)等。

2.4 标本图片拍摄

对已完成形态学分类鉴定的标本，依照整体照、特征照的形式，对每个标本拍摄不少于2张标本图片，要求能全面反映标本的形态特征，照片与标本相对应。

2.5 标本DNA条形码信息

需DNA条形码识别的标本使用无菌剪、无菌手术刀片获取动物组织：昆虫、甲壳动物取足部，环节动物、软体动物、扁形动物取身体软组织(避开消化道)，如个体实在太小(如部分摇蚊幼虫)，则选取完整个体，用纯水和75%乙醇溶液分别清洗取出的身体组织约5 mg，保证无杂质、无污染[9]。如所获取的标本DNA条形码信息非供初建标本库使用，可用初次置换下的无水乙醇保存液做提取DNA的材料。接着进行DNA提取、PCR扩增与产物电泳、基因序列测定分析以获得标本DNA条形码信息。

2.6 鉴定完毕标本制作与记录

生物标本主要有剥制标本、浸制标本、干制标本和玻片标本等类型，环境生物监测底栖无脊椎动物标本保存、利用以浸制标本为主，以干制标本及玻片标本为辅。鉴定完毕后大型软体动物外壳灭菌晾干制成干制标本；需用显微镜观察的可制成以加拿大树胶封片的玻片标本；其余均可制成浸制标本。浸制标本制作时需先对底栖动物用去离子水清洗，洗去固化的体液及杂质残留，再将较大的底栖动物装入大口密封盒，将较小的其他动物标本放入透明玻璃制螺纹口标本瓶中，加入80%乙醇溶液或5%福尔马林(2%甲醛)溶液。配置保存液的原液以工业级纯度及以上为佳，水以去离子水及以上为佳，以免形成少量絮状沉淀。标本容器材质以硅硼玻璃、有机玻璃为佳，盖上107硅橡胶[10]或泡沫硅橡胶为内衬的塑料密封盖，塑料密封盖需良好的抗化学物质性，一般PET、PP材质均可。标本容器大小可依据标本大小定制，常用大口密封盒为1～3 L容积，螺纹口标本瓶为20～50 mL容积，固定液面不低于容积的3/4。

干制标本的外壳、玻片标本的玻片、浸制标本的标本瓶外均需贴制标签，详细记录标本信息：标本编号、物种名称、拉丁文名称、标本性别、采集地点、采集日期、保存介质、鉴定人员、制作标本机构名称。进行DNA条形码识别的标本增加相应二维码标识，表明其特征DNA序列。

完成标本制作后，填写记录：标本图片、标本实物、鉴定记录都一一对应。

2.7 标本审核

对已制作完成的标本，执行标本审核：先由受过底栖动物分类鉴定训练而非鉴定者本人复核，再由经验丰富的底栖动物分类鉴定主管或科研院所相关专家审核标本制作、标本信息是否正确完整，审核完成后，在相关证明材料上签字。如审核出现疑问的标本，可先置于暂存柜，待累积到一定量后，请相关权威专家甄别做出审核意见，根据意见最终完成标本审核。

2.8 标本入库、展示与维护保养

对审核完成的标本进行入库，按照标本柜中已经分区的动物类别上架，同时将文本资料、电子资料归档，交由档案管理部门统一管理。

对已入库的标本可用作展示，主要以标本柜为整体进行，标本柜分区可对不同物种进行展示，大型软体动物展示效果较好；其他动物可以将个体与显微镜照片对应，在标本展示区设置显示屏，通过标号一一调用其显微镜照片，保证科学性、直观性。

实体标本入库时保证完好，应先对保存柜需先进行一次清洁后移入标本瓶。实体标本保存房间保持可通风，室温(20±5) ℃，湿度小于70%，避免阳光直射，每3个月检视标本，固定液减少的添加至原有量，如甲醛溶液因生成仲甲醛而浑浊，乙醇溶液出现发黄的情况，必须更换原固定液。此外，还需进行防尘措施，可设置防尘缓冲带和定期对标本瓶外进行擦拭以除尘，同时对地面尘土进行清扫，确保无尘。标本在搬运后易出现受损，需及时维护到位[11]。

2.9 参考标本

为确认分类鉴定结果，所有鉴定出的实物样品均可作为参考标本。单个点位的参考标本需一一记录，标本库、暂存柜内单个点位的标本信息都需以单独的报表或表格登记，明确：采集地点、采集日期、采样量、物种名称、学名、门类、样品编号、固定剂成分、鉴定日期、个体数量(个)、个体质量(g)、个体密度(个/m2)、生物量(g/m2)、鉴定日期、鉴定人员、复核人员、审核人员。保存方法与一般标本相同。参考标本确认的有关要求包括：

(1) 参考标本的确认可进行同行评议，但最终确认必须由底栖无脊椎动物分类鉴定顾问组2～3专家鉴定签字确认，顾问组专家为国内大型底栖无脊椎动物分类鉴定公认的知名专家，不同的人仅负责自己的专业领域。

(2) 参考标本的确认具体进行如下工作：① 对制作单位提出的物种鉴定报告(须阐述鉴定的主要依据)提出质询。② 判断待审侯选参考标本的鉴定是否正确，确认相应实验室对该物种的分类鉴定能力。③ 判断待审侯选参考标本的主要特征是否典型鲜明，具有普遍性和代表性，是否适合作为参考标本。④ 评估待审侯选参考标本的完好性及质量，判断其是否适合作为参考标本。⑤ 专家间产生异议，意见不能统一的，以不通过定论。⑥ 对意见一致的待审侯选参考标本出具参考标本鉴定结果报告，签字确认。

(3) 必要时，可咨询专家给出相应物种分类鉴定的方法，经验及注意事项等。

2.10 凭证标本(模式标本)

凭证标本是一类受权威专家认可、个体特征明显、DNA信息明确、标本保存完好、记录完整、需永久保存的实物标本，又称模式标本，包括物种发现时的正模标本、副模标本和配模标本，但又不局限于物种发现时的这几类稀有标本。这类标本可以帮助确认其种类的特征，也能帮助确认新物种的发现和已知物种的新记录。所有的凭证标本必须在管理部门、相关组织机构登记，单独保存，单独建卡，保存等级远高于一般标本，每次维护保养均需涉及并仔细检查，标本出现问题需及时处理并将情况公告、上报。一般来说，普通实验室的普通人员要接触到凭证标本的可能性小，因此，环境监测生物实验室必须建立自己的参考标本和参考标本库。

2.11 样地标本

样地标本是按固定或不固定时间间隔采集典型样地的样品，经分类鉴定、计量统计后获得，样地标本标识典型样地、采样时间、采样人员、固定剂成分、已鉴定生物名称及表格(包括学名)、鉴定日期、鉴定人员等，以浸制标本、玻片标本、干制标本等形式，按典型样地-采样时间-生物类型等要素分类保存，样地标本为永久保藏标本，应尽量避免损坏，可从中取样进行研究利用。

2.12 标本录入、查询与调用

标本电子数据同实物一同入库，数据资料在输入后需经复核、审核，妥善归档保存，从而可以进行数据查询和用作水生态健康管理的原始数据予以调用。

3 底栖动物标本库的管理制度

3.1 底栖动物标本出入库管理制度

(1) 底栖动物标本入库时经制作、复核、审核后方可入库，登记为参考标本的单独记录并归档，登记为凭证标本的除单独记录和归档外还需环境管理部门登记。所有标本供本区域范围生态环境质量监测、生物多样性保护规划参照和历史比对、科研分析和交流、科普活动和展览等项目使用。

(2) 仅在本单位调用参考标本时，需做好登记：使用标本目的、出库时间、归还时间、有无损坏、经手人签名等信息；当外单位调用参考标本时，向本单位做出使用标本目的、出库时间、归还时间、标本由何人何地进行使用的说明，单位审批同意后即可外借，同时内部也需做好登记。

(3) 凭证标本为科研项目的实施和运行提供基础的支撑、保障作用[12]。其调用必须向管理部门、相关组织机构报批，同意后方可进行操作，并将使用标本目的、出库时间、归还时间、标本由何人何地进行使用出具详细书面说明，经单位审核后方可外借，同时在实施过程中应根据实际情况制定细则。

(4) 底栖动物标本出库后归还入库时，需要工作人员、管理人员认真检查，保证无破损、无遗失[13]。如有破损或遗失情况，应及时上报并追究出借方责任，同时标本库人员需尽可能对标本进行保养修复。

应构建长效性扶持机制，项目支持不只局限于前期建设阶段，也应向中后期运行阶段延伸。加大政策扶持力度，提高项目资金补助标准，补贴应尽可能弥补秸秆收储人工和运输成本，提高秸秆利用主体积极性。实行区别化补贴和奖励标准，引导产业发展向技术含量高、附加值高的利用方向发展。拓宽政策扶持广度，降低项目申报门槛，尽可能让政策惠及每一个产业链主体，最大限度调动各方面积极性。政府部门需密切协作、形成合力，在财政、税收、土地等各方面完善政策优惠体系，通过完善利益链驱动产业链发展，最终形成以政策为导向、企业为主体、农民广泛参与的秸秆综合利用长效机制。

3.2 底栖动物标本保藏管理制度

(1) 底栖动物标本保存房间应建立专人负责制，指定工作人员和管理人员，每3个月对标本保存情况、保存设施检查记录并进行保养维护。具备灭火设施和影像监控，保证房间安全，每周对房间进行打扫、通风，做好记录。

(2) 底栖动物标本保存房间需具备温湿度调控器、温湿度计或在线温湿度监控，并按时进行记录，室温保持(20±5) ℃，湿度小于70%，避免阳光直射。

(3) 每3个月检视实体标本和电子数据，出现保存液浑浊变色、标签脱落或字迹不清、标本瓶密封问题或损坏、电子运行故障时，应及时更换、修复、备份，保证其正常。

4 底栖动物标本库的质量控制

4.1 人员质控

涉及底栖动物项目所有人员需纳入单位人员管理程序统一管理，参与底栖动物分类鉴定和底栖动物标本库工作的人员，必须由技术管理部门经过专业培训，具备相应资格和经验，具有对结果做出正确判断能力和熟知质量要求的人员方可上岗。

实验室底栖动物方向技术管理者应为获得在底栖动物研究范围内的实验室认可与计量认证成员，并具有生物专业或底栖动物研究专业密切相关的本科以上学历和5年以上底栖动物研究专业相关的工作经历。

建立省级底栖无脊椎动物分类鉴定专家组及顾问组，专家组由省内环境监测中心有10年以上大型底栖无脊椎动物分类鉴定经验、高级工程师职称以上的专家组成，顾问组由国内外大型底栖无脊椎动物分类鉴定知名专家组成。专家组作为底栖无脊椎动物分类鉴定QA/QC的管理的执行机构，省级质量管理相关部门定期组织专家组对有关实验室进行培训、考核、质量检查、同行评议、实验室间比对及能力验证等工作。顾问组作为咨询机构提供参考标本最终确认等咨询服务。每2～3年，必须接受与底栖动物研究相关的一次培训或一次会议，同时实验室资料应保持随时更新。同时相关的培训、参会和资料更新需予以留档备查。

4.2 器材质控

涉及底栖动物项目所用器材需纳入单位仪器设备管理程序统一管理，对仪器设备使用、维修、保养、报废进行有效控制，所有的仪器设备均有明显标识表明其状态，对结果有影响的采样设备和实验室设备，均需加以唯一性标识。

底栖动物室内研究使用的显微镜包括体视显微镜和正置显微镜两种，携带测微尺和拍照功能为佳，称重所用天平为万分之一天平。需对显微镜、天平定期维护保养保持性能良好，并做好使用记录、维护保养记录、使用期间核查记录、修理记录等。

保存底栖动物的保存容器保证密封、坚固、具良好的抗化学物质性，存放底栖动物的房间保持可通风，室温20±5℃，湿度小于70%，避免阳光直射，存放情况需予以记录。

4.3 标本质控

底栖动物实体标本制作和电子资料制作均需符合生物实验室底栖动物标本库的相关要求，实施质量控制可采用(但不限于)以下方式：

(1) 定期使用参考标本、凭证标本对不同分类级别进行标本制作内部质量控制。

① 准确度控制。将多个不同门、纲、目、科的参考标本混合制成定量标本，控制分类级别为门、纲、目、科的底栖动物分类准确度；将多个不同属、种的参考标本不同分类特征部位制成概念标本，控制分类级别为属、种的底栖动物分类准确度[14]，以公式计算正确率，控制限为80%，高于此限判为合格；

② 双样精密度控制[15]。将某种凭证标本和同种的参考标本进行对比观察，分别描述其分类特征的区别，描述后确认其偏差。但标本特征不同于理化数值，不同人员描述均会产生不同程度的偏差，故有时也在物种双名法定名人名字后，添加不同描述人名字予以标注，甚至一些新种、亚种的发现也离不开多次描述。精密度仅控制学术上公认的核心特征，双样对比描述相对偏差容许值应为10%，低于此限判为合格：

式中：X1为凭证标本核心特征数；X2为同种参考标本核心特征数。

(2) 参加同一标本不同实验室间比对和能力验证活动。

(3) 监控同一人员不同标本分析制作能力及不同人员对同一标本分析制作能力[16]。

(4) 同一标本形态学分类和DNA条形码监测结果比对分析。

(5) 定期监控、审核电子资料，比对国内外发表的论文、网站资料与实体标本情况，更新完善电子资料。

4.4 记录质控

涉及底栖动物项目所用记录需纳入单位记录控制程序统一管理，对记录的识别、收集、索引、使用、存档、维护和处置进行有效控制。

底栖动物标本库记录需质量记录和技术记录，质量记录有标本库内部审核记录和标本库管理体系文件控制记录；技术记录有标本采样分析记录、标本审核记录、标本保存记录、标本库流转记录、参考标本档案记录、凭证标本档案记录、人员培训考核记录、实验室间比对和能力验证记录、仪器设备使用维护运行记录、标本质量控制评审记录。

5 结论和展望

本文以环境监测系统生物实验室对底栖动物的分类鉴定和标本制作多年经验总结，详细介绍从底栖动物标本获取到研究获得的所有信息，以及这些信息的保存、利用、流转的各个步骤和对其进行的质量控制手段，为获得真实、详细、准确、易用的底栖动物数据做出探索，同时为丰富和规范底栖动物资源库，保护和宣传底栖动物多样性做贡献。

底栖动物标本库的建立对底栖动物的研究、标本交流、多样性发展有意义重大，在学校及科研院所展开对其形态学、遗传学的研究，可以阐明生物分布、进化、交流的各种信息；在环境监测、水文水利等政府部门展开对其分布情况的研究，可以阐明环境污染情况和环境保护需要对应的方向，同时进行系统内的质控和技术培训；在博物馆、资源中心、科教馆展开对其收集、维护、展出，可以达到对公众的教育科普。未来更可以综合以上部门的需求，让同一标本发挥其不同功能，甚至与世界大型博物馆的标本进行交流，使得标本库与国际接轨。