厌氧微生物培养装置实验教学改革与实践

蒋海明， 王路路， 李 侠， 张 鹏， 沙浩男， 刘振旺， 李雅丽

(内蒙古科技大学 a. 生命科学与技术学院；b. 矿业研究院，内蒙古 包头 014010)

0 引 言

厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，作用也日益引起重视。厌氧微生物培养的关键是要使该类微生物培养时处于无氧的环境中。目前，厌氧微生物培养一般采用厌氧管[1-3]、厌氧瓶[4-8]、厌氧罐培养法[9-10]及厌氧手套箱[11-13]。厌氧管体积较小(≤30 mL)，一般只适合少量微生物培养(≤10 mL)。厌氧罐与厌氧培养箱虽可用于厌氧微生物培养，但也存在许多不足，如价格昂贵、体积较大、不能恒温及不适合极端厌氧微生物(如海底菌种、深层土壤菌种)培养，且一般本科实验室配置较少或不配置，因而无法满足本科厌氧微生物实验教学需求。在实验室，厌氧瓶的应用较广泛。厌氧瓶体积可变(50～1 000 mL)，既可适用少量厌氧微生物的培养，也可适用大量厌氧微生物培养。实验室使用的厌氧瓶分进口和国产两种，进口厌氧瓶耐高温、高压且不易爆炸，但价格昂贵，不宜在本科实验教学中大量使用。国产厌氧瓶虽然价格较低，但高温下耐高压性能差、易爆炸，厌氧瓶的爆炸除对灭菌设备造成损坏外，更危及实验人员的生命安全。此外，常规厌氧瓶在使用过程中，瓶口最容易造成损坏，一旦厌氧瓶的瓶口损坏，则整个厌氧瓶无法再使用，需购置新的厌氧瓶，而购置新的厌氧瓶成本又高。张祥胜等[14]设计了一个简易厌氧生物反应器，但是该装置不能实现纯厌氧微生物的培养、厌氧微生物的分离与纯化，因为其装置无法实现曝气脱氧。此外，该装置成本较高。因此，如何设计一种耐高温、高压、不易爆炸、价格低且使用寿命长的厌氧微生物培养、分离及筛选装置，对厌氧微生物培养、厌氧微生物的实验教学及研究都具有重要意义。

针对现有实验室厌氧微生物培养装置存在的问题，本研究设计及制备了一种模块化多功能厌氧微生物培养装置，该装置具有结构简单、体积可变、成本低及使用寿命长等优点，可用于二氧化碳、氮气及H2/CO2等气氛厌氧微生物的培养。本装置为我校微生物学、环境微生物技术及发酵工程的实验教学创造了良好的实验平台并取得了很好的教学效果。

1 厌氧微生物培养装置的设计、制备及性能检测

1.1 厌氧微生物培养装置的设计

根据厌氧微生物培养的要求和特点，设计了模块化厌氧微生物培养装置，其结构示意图如图1所示，主要包括顶端开孔的盖子、T型丁基橡胶塞、喇叭形螺纹口玻璃管(或喇叭形钳口玻璃管)、开孔GL45耐高温(140～180 °C)玻璃瓶盖、316L不锈钢垫片、开孔T型硅橡胶塞子及高硼硅螺纹口玻璃瓶。高硼硅螺纹口玻璃瓶壁厚耐高温、高压，可以避免密封灭菌时爆炸，克服了国产厌氧瓶高温不耐压的缺陷，同时其广口有利于装、卸料。将厌氧管的底端改为喇叭口形，既可固定螺纹口玻璃管，又能在高压灭菌时将开孔T型硅橡胶塞子紧紧挤压在高硼硅螺纹口玻璃瓶瓶口内壁，从而起到密封的作用。此外，喇叭形螺纹口玻璃管可更换，且价格较低，可以避免常规厌氧瓶因瓶口损坏而导致整个厌氧瓶无法再使用，需购置新的厌氧瓶的不足。316L不锈钢垫片的使用避免了GL45耐高温开孔玻璃瓶盖与开孔T型硅橡胶塞子之间的摩擦，既保护了开孔T型硅橡胶塞子，又使开孔T型硅橡胶塞子与高硼硅螺纹口玻璃瓶之间密封更好。

1-高硼硅螺纹口玻璃瓶；2-喇叭形螺纹口玻璃管；3-开孔T型硅橡胶塞；4- 316L不锈钢垫片；5- 开孔GL45耐高温(140～180 °C)玻璃瓶盖；6-T型丁基橡胶塞；7-顶端开孔盖

图1 厌氧微生物培养装置剖面结构示意图

1.2 厌氧微生物培养装置的加工与组装

1.2.1厌氧微生物培养装置的加工

按照厌氧微生物培养装置的设计加工及购买相关的组件：喇叭形螺纹口玻璃管(壁厚2 mm，由φ18 mm×150 mm螺纹口厌氧管改装而成)[见图2(a)]或喇叭形钳口玻璃管(壁厚2 mm，由φ20 mm×150 mm钳口厌氧管改装而成)[见图2(b)]、高硼硅螺纹口玻璃瓶(250 mL)(由250 mL螺纹口试剂瓶改装而成)[见图2(c)]、开孔T型硅橡胶塞[见图2(d)](设计模具，加工制备)、316L不锈钢垫片[见图2(e)]、GL45开孔耐高温螺口玻璃瓶盖(由GL45耐高温螺口玻璃瓶盖中间钻孔而成)[见图2(f)]及厌氧管盖子与T型丁基橡胶塞。为使装置的密封性好，开孔T型硅橡胶塞的内孔直径需比喇叭形螺纹口玻璃管外径小1 mm，且喇叭形螺纹口玻璃管的喇叭口外径比玻璃管外径大6 mm。开孔GL45耐高温螺口玻璃瓶盖开孔直径一般比喇叭形螺纹口玻璃管外径大4 mm，但要小于30 mm。316L不锈钢垫片内孔直径一般比喇叭形螺纹口玻璃管外径大2～4 mm，但要小于30 mm，且比开孔GL45耐高温螺口玻璃瓶盖开孔直径小。表1为250 mL带刻度厌氧微生物培养装置的成本构成。由表1可知，每个厌氧微生物培养装置的成本为22元，而市场上国产250 mL厌氧瓶的价格为16～36元/个，进口Thermo Fisher Scientific品牌200 mL厌氧瓶的价格为220元/个、250 mL厌氧瓶(带刻度)为1100元/个。本研究设计、加工的厌氧培养装置价格位于国产厌氧瓶价格范围内，但约为进口厌氧瓶价格的1/50～1/10。

(a)喇叭形螺纹口玻璃管(b)喇叭形钳口玻璃管(c)高硼硅螺纹口玻璃瓶

(d)开孔T型硅橡胶塞子(e)316L不锈钢垫片(f)GL45开孔耐高温瓶盖

图2 厌氧微生物培养装置各主要组件的尺寸及剖面结构示意图(mm)

1.2.2厌氧微生物培养装置的组装

按照图1所示的结构组装厌氧培养装置：

(1) 将喇叭形螺纹口玻璃管穿过开孔T型硅橡胶塞至喇叭口端与T型硅橡胶塞的小端紧密接触[见图3(a)]；

(2) 将固定有喇叭形螺纹口玻璃管的T型硅橡胶塞塞进高硼硅螺纹口玻璃瓶，使T型硅橡胶塞的大端与高硼硅螺纹口玻璃瓶瓶口紧密接触[见图3(b)]；

(3) 将喇叭形螺纹口玻璃管的螺纹口端用T型丁基橡胶塞塞紧，并拧上配套的开孔盖[见图3(c)]；

(4) 将316L不锈钢垫片穿过喇叭形螺纹口玻璃管的螺纹口端至T型硅橡胶塞的表面，然后利用GL45耐高温玻璃瓶瓶盖将316L不锈钢垫片及开孔T型硅橡胶塞紧紧固定在高硼硅螺纹口玻璃瓶上，以完成整个装置的组装[见图3(d)]。

1.3 厌氧微生物培养装置气密性检测

以氮气为检测气，对安装好的厌氧微生物培养装置的气密性进行检测。将装置连接到N2气路上，打开阀门，通过注射器针头充入N2，然后依次将肥皂水滴加到厌氧微生物培养装置的所有连接处，以对各个连接处的气密性进行检查。如果滴加肥皂水的连接处冒泡，则说明该连接处有泄漏，否则说明该连接处密封好。各连接处气密性的检测结果表明该厌氧微生物培养装置的气密性非常好。

(a)(b)(c)(d)

图3 厌氧微生物培养装置安装过程示意图

1.4 厌氧微生物培养装置安全性检测

制备好的厌氧微生物培养装置(250 mL)加入100 mL去离子水，密封后置于灭菌锅中121 °C灭菌30 min以检验厌氧微生物培养装置的安全性。实验结果表明在该条件下反复灭菌10次(3个厌氧微生物培养装置)，没有1个厌氧微生物培养装置发生破损，说明制备的厌氧微生物培养装置安全可靠。

2 厌氧微生物培养装置实践

利用自制实验室厌氧微生物培养装置培养GeobactersulfurreducensPCA(ATCC 51573)及Geobactergrbiciae(ATCC BAA-46)与Methanosarcinabarkeri800(ATCC 43569，DSM 800)的co-culture，以检验该装置的有效性。

2.1 Geobacter sulfurreducens PCA的培养

GeobactersulfurreducensPCA的培养参考Tremblay等[15]的方法。采用Ferric citrate(III)(FC)培养基培养GeobactersulfurreducensPCA。柠檬酸铁溶液(40 mmol/L)的配制参考Tremblay等[15]的方法。250 mL厌氧微生物培养装置中加入95 mL FC培养基，插入曝气针后塞上丁基橡胶塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝气45 min后密封，121 °C灭菌30 min后冷却到室温待用。用2.5 mL注射器向厌氧微生物培养装置中加入1.0 mL微量微生素溶液(N2脱氧)及1 mL乙酸钠溶液(2 mol/L)(N2脱氧)，厌氧环境接种5 mLGeobactersulfurreducensPCA(5%接种量，V/V)后置于30 °C下培养。图4为使用本研究设计的厌氧微生物培养装置培养GeobactersulfurreducensPCA情况。图4(a)为未接种G.sulfurreducensPCA的FC培养基，图4(b)为接种G.sulfurreducensPCA并培养12 d后的FC培养基。从图4中能够看出未接种G.sulfurreducensPCA的FC培养基颜色没有发生变化，而接种G.sulfurreducensPCA并培养12 d后的FC培养基颜色明显变淡且溶液浊度增加，菌种生长良好，这表明该厌氧微生物培养装置满足G.sulfurreducensPCA的生长要求。

(a)未接种G. sulfurreducens PCA(b)接种G. sulfurreducens PCA

图4 未接种与接种G.sulfurreducensPCA FC培养基颜色变化

2.2 G. grbiciae与M. barkeri co-culture的培养

G.grbiciae与M.barkerico-culture的培养参考Rotaru等[16]的方法。将NBM(Media NB modified)培养基置于三角瓶中，用铝箔纸密封后煮沸，然后将煮沸的培养基置于冰域中，利用厌氧微生物培养基制备装置气路通入N2/CO2(V/V=80∶20)混合气使其冷却至室温。250 mL厌氧微生物培养装置用N2/CO2(V/V=80∶20)混合气脱氧10 min，然后用移液器量取90 mL NBM培养基至厌氧瓶中，厌氧瓶插入曝气针后塞上丁基橡胶塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝气45 min后铝盖密封，121 °C灭菌30 min后冷却到室温待用。制备好的培养基厌氧环境用2.5 mL注射器加入1.0 mL微量微生素溶液(N2脱氧)、1 mL还原剂(100 mmol/L L-Cysteine 和 50 mmol/L的Na2S混合溶液)(N2脱氧)、4 mL纳米四氧化三铁液体(10 mmol/L)(N2脱氧)及1 mL乙醇溶液(2 mol/L)(N2脱氧)，厌氧环境接种M.barkeri与G.grbiciae构成的混合微生物(10%接种量，V/V)后置于37 °C下培养。利用气相色谱定期检测厌氧瓶中甲烷的浓度[15]。厌氧瓶中甲烷的量随时间变化如图5所示，接种培养72 d后厌氧瓶中甲烷的量达(2.09±0.58) mmol (±SD，n=3)，这说明使用自制的厌氧微生物培养装置成功地培养了G.grbiciae与M.barkeri的co-culture。G.grbiciae与M.barkeri都为严格厌氧微生物，而两种微生物在自制的装置中都能生长，这充分说明了该装置在严格厌氧微生物的培养时非常有效。

图5G.grbiciae与M.barkeri的co-cultures耦合代谢乙醇产甲烷

3 结 语

本文设计与制备了实验室模块化厌氧微生物培养装置，并将该装置用于严格厌氧微生物GeobactersulfurreducensPCA及Geobactergrbiciae与Methanosarcinabarkeri800 co-culture的培养，实验结果表明该装置完全满足严格厌氧微生物的培养，可用于厌氧微生物的培养、分离纯化及筛选。该装置具有原料易得、模块化设计、制作简单、体积可变(0.1～20 L)及使用灵活等优点，其性能达到进口厌氧瓶的要求，但成本远低于进口厌氧瓶(约为其价格的1/50～1/10)，适用于批量厌氧微生物的培养。本装置为微生物学、环境微生物技术及发酵工程的实验教学创造了良好的实验平台并取得了很好的效果。通过设计及制备“实验室模块化多功能厌氧微生物培养装置”，不仅改善了学校的实验教学条件，更重要的是引导学生将所学的金工、机械制图、AutoCAD及生物学等知识有机结合后应用到一个具体工程项目，有助于培养和提高学生的协同合作、查阅文献、实验探索、工程实践及科技创新能力，最终达到培养学生创新意识、创新精神和创新能力的目的。