电针对脑缺血-再灌注损伤大鼠运动功能的改善作用及机制研究*

王海英 亚白柳 王文淼 刘文彦△

(1济宁医学院基础医学院；2济宁医学院行为医学重点实验室，济宁 272067)

针刺在中国已经应用了数千年，是中国传统医术的一种。电针是结合了现代技术后的产物，它是指在毫针针刺的基础上输入脉冲电流[1]，来达到治病的目的[2]。电针技术已广泛应用到缺血性脑损伤的临床治疗中。缺血性脑损伤的发病率高，其死亡率已居于我国疾病死亡原因的前6位[3]。而内质网对机体的内、外环境的变化极为敏感，葡萄糖调节蛋白 ( glucose regulated protein,GRP78)通常被认为是内质网应激的标志物，可以促进内质网中未折叠蛋白的修饰和正确折叠，对内质网的功能具有保护作用[4]；caspase12是存在于内质网上的促凋亡因子，正常状态下与GRP78结合，而过强的刺激可使caspase12激活，启动凋亡通路[5]。本实验通过观察电针对大鼠脑缺血-再灌注不同时间的GRP78和caspase12表达的变化以及肢体运动功能的修复情况，探讨电针的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级SD大鼠，雄性，体重(220±10)g，购于山东鲁抗医药股份有限公司(合格证号：SCXK鲁20130001)。实验动物于术前自由喂食和饮水，饲养温度(20±2)℃，恒定湿度(50±5)%，12h循环光照，以维持基础状态。所有动物实验均遵循国家实验动物饲养管理条例和使用指南以及济宁医学院实验动物管理条例。caspase12 mRNA RT-PCR扩增和GRP78免疫荧光实验(只有3h、6h、12h和24h组)：SD大鼠随机分为对照组(sham组，5只)、脑缺血-再灌注组(I/R组，30只)和再灌注时间点+电针组(I/R+EA组，30只)，I/R组按再灌注时间点分为3h、6h、12h、24h、72h、120h 6个亚组，每组5只，I/R+EA组根据I/R各亚组时间点对应分为6组，每组5只。大鼠转棒式疲劳仪实验：35只SD大鼠随机分为sham组(5只)、I/R组(15只)和I/R+EA组(15只)，I/R组和I/R+EA组根据时间点7d、14d和30d各分为3个亚组，每组5只。

1.2 方法

1.2.1动物模型的制备[6]制备MCAO模型，按照Longaⅴ级评分法于术后清醒1h后给实验动物评分，1～3分的动物为模型制备成功。

1.2.2电针方法[7]大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，于再灌注开始后30min，对“水沟”和“百会”穴进行电针刺激，持续30min，最后一次电针结束后30min取材。

1.2.3肢体运动功能修复[8]各组实验动物于术后3h统一进行评分，选择评分4～5级的大鼠为疲劳棒实验模型成功动物，I/R+EA组大鼠每天电针治疗1次、30min，连续电针干预7d，对再灌注7d、14d和30d组的大鼠进行疲劳转棒仪实验，40转/min，各组分别于术前进行训练，选择能在疲劳转棒仪上停留2min以上的大鼠，分别于术后第2天开始，每天训练2次，分别于再灌注7d、14d和30d进行疲劳转棒测试，每只大鼠测5次，记录大鼠在疲劳转棒仪上停留的时间，取平均值，最长停留时间为15min即停止疲劳转棒仪，观察大鼠肢体运动功能恢复状况。

1.2.4RT-PCR检测caspase12 mRNA 用DNAstar软件设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 caspase12 mRNA引物序列

1.2.5GRP78免疫荧光实验 制备冰冻切片，厚度12 μm，加入GRP78一抗工作液，4℃过夜，加入荧光二抗，PI工作液室温复染，激光共聚焦显微镜观察FITC标记的阳性反应物[8]。FITC是波长为488 nm蓝色激发光，波长为515 nm的绿色观测光。每个鼠脑标本选取不连续的4张切片，每张切片计数4个视野， 取细胞计数的平均值进行统计学分析[9]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠肢体运动功能指标变化

I/R+EA组(7 d和14 d)大鼠在转棒上停留时间与对应的I/R组相比显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R+EA组(30 d)大鼠在转棒上停留时间与对应I/R组相比变化不明显(P>0.05)。见表2。

表2 3组大鼠在转棒上停留的时间(秒，

2.2 各组大鼠脑组织caspase12 mRNA表达情况

与sham组相比，脑缺血-再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h后大鼠脑组织中caspase12在mRNA水平上的表达显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；电针干预后caspase12 mRNA的表达与I/R组相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表3。

2.3 大鼠脑组织GRP78的表达情况

3h、6h 、12h、24h I/R+EA组大鼠缺血部位脑组织GRP78阳性细胞数和对应的I/R组比较显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表4。

表3 3组间caspase12 mRNA的表达

注：胞浆内GRP78阳性呈绿色，60×，1为sham组； 2、3、4和5为3 h、6 h、12 h和24 hI/R组；6、7、8和9为对应时间点I/R+EA组。

表4 3组间GRP78阳性细胞数比较(个/视野，

3 讨论

脑血管病是临床上的常见病，其中缺血性脑卒中所占的比例最高，严重危害了人类生命及健康。近几年，对于缺血性脑卒中的治疗及机制方面的研究取得很大的进展[10]。脑缺血区分为急性缺血中心区和周围缺血半暗区[11]，脑缺血损伤侧大脑半暗带广泛存在凋亡现象，以缺血损伤侧大脑皮层及纹状体为甚，神经元对缺氧刺激因素比较敏感，可发生神经细胞坏死。

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞内重要的细胞器，参与机体许多重要生理功能的维持，包括信号肽的识别、糖基化修饰以及细胞内Ca2+超载等[9,12]。内质网异常敏感，当细胞内发生一系列反应时，都可以导致ER功能障碍，比如：糖基化抑制、蛋白质转运异常[13]、二硫键形成障碍等，即发生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[14]。在许多分子伴侣蛋白的协助下，蛋白质在内质网内可以发生正确折叠，其中，分子伴侣蛋白包括Bip/Grp78(immunoglobulin binding protein78)和Grp94(glucose-regulated protein94)等。Hayashi 等[15]认为,GRP78 而非GRP94决定了神经元对缺血性损伤的敏感性。此外，内质网应激能促进IRE1介导的转录因子CHOP基因表达和caspase12的激活，参与凋亡的过程[16]。

疲劳转棒仪实验能通过对大鼠运动功能的测试，观察大鼠肢体运动功能修复状态，包括大鼠运动协调能力和肢体力量，是反应神经功能的修复情况的很好的行为学指标。本文结果显示，电针干预可以帮助大鼠修复肢体的运动功能及肢体协调能力，从而促进大鼠神经功能恢复；脑缺血-再灌注损伤后脑组织中caspase12在mRNA表达上调，所对应的再灌注时间点，经电针干预后caspase12 mRNA的表达明显降低；脑缺血-再灌注损伤后大鼠脑细胞GRP78表达明显升高，电针干预后GRP78的表达显著降低；电针干预后能下调缺血侧脑组织中GRP78和caspase12 mRNA的表达。GRP78和caspase12是内质网应激的相关蛋白，也是内质网介导的凋亡通路的关键因子，GRP78的过度表达能使神经元对缺血性损伤的敏感性增强，加速神经元的损伤；caspase-12位于内质网的胞浆面，能与其他内质网应激分子协同，最终导致细胞凋亡；最新的研究显示，caspase12也能独立引发细胞凋亡。因此，我们推断电针促进缺血性脑损伤大鼠肢体运动功能修复可能与阻断内质网介导的凋亡通路有关。

综上所述，电针干预能通过降低脑细胞内caspase12 mRNA和GRP78的表达帮助修复大鼠肢体的运动功能，发挥脑保护作用，为探讨电针治疗缺血性中风的作用机制提供了有效的实验依据。