鼠源VCAM-1真核表达载体构建及在同源细胞中过表达研究

王兴陇，李向茸，李 倩，马瑞仙，李生军，李琼毅，张海霞，马忠仁，冯若飞

(1. 西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；3.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030)

血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)是Ig超家族成员中的I型跨膜糖蛋白，分子量为100～110 kDa，含有674个氨基酸，其配体是VLA-4分子，分布于白细胞表面[1].VCAM-1基因含有7个免疫球蛋白结构域，仅在内皮细胞被细胞因子刺激后才在大血管和小血管上表达[2-4].炎症疾病期间，VCAM-1通过几种介质(包括ROS)在内皮细胞上诱导VCAM-1的表达，如细胞因子信号通过高水平的短寿命ROS诱导内皮细胞中VCAM-1的表达，激活NF-κB通路[5-8].然后内皮上的VCAM-1既作为白细胞迁移的支架，又可作为通过NADPH氧化酶产生的ROS产生内皮信号的触发器，导致内皮细胞内产生超氧化物和过氧化氢，对内皮细胞产生损伤[9-11].炎症通过抑制白细胞与VCAM-1结合或通过抑制VCAM-1信号转导而被阻断，VCAM-1信号转导和VCAM-1依赖性炎症被抗氧化剂阻断.因此，VCAM-1信号传导是炎症性疾病过程中药物干预和抗氧化剂干预的目标.在病毒受体的相关研究中，VCAM-1被鉴定为EMCV-D 在鼠类血管内皮细胞上的受体[12].

VCAM-1是EMCV-D 在鼠类血管内皮细胞上的受体，并且VCAM-1参与机体的免疫反应、炎症反应、肿瘤的发展及转移等多种病理生理过程[13-14].因此本文建立了小鼠成肌细胞(C2C12)的VCAM-1过表达方法，为之后VCAM-1与EMCV病毒感染研究建立了基础，同时为VCAM-1与疾病相关研究提供了技术支持.

1 材料与方法

1.1 细胞、菌体及载体

小鼠成肌细胞(C2C12)由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供；感受态细胞BL21、表达载体pcDNA3.1(+)均由生物工程与技术国家民委重点实验室(西北民族大学)提供.

1.2 主要试剂

0.25%胰蛋白酶、DMEM培养基均购自兰州百灵生物技术有限公司；新生牛血清(NBS)购自兰州民海生物工程有限公司；Opti-MEM购自美国Gibco公司；培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、高纯质粒小提试剂盒、dNTPs(10mM)、TIANScript M-MLV均购自北京天根生化科技有限公司；Oligo(dT)18、RNase Inhibitor均购自生工生物工程(上海)有限公司；TaqDNA聚合酶、pMD18-T、EcoR I 、Kpn I 限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司；LipofectamineTM2000 Reagent 购自Invitrogen公司；Power SYBR Green PCR Master Mix购自美国Applied Biosystems公司；兔抗VCAM-1单克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体购自Abcam公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 594均购自Jackson公司；DAPI染色液购自碧云天生物技术研究所.

1.3 引物设计与合成

针对鼠源VCAM-1 (GenBank登录号：X67783.1)的基因序列应用Primer Premier 5.0与DNAStar软件进行引物设计，同时在引物序列上加入酶切位点，分别设计VCAM-1全长基因的特异性引物VCAM-1-F/R、荧光定量PCR引物VCAM-1-qF/R和鼠源mGAPDH-qF/R荧光定量PCR引物，由上海生工合成(见表1).

表1引物序列

1.4 VCAM-1基因提取与扩增

分别收取C2C12细胞，利用天根总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，反转录后获得cDNA，进行PCR扩增.PCR反应体系为：DEPC H2O 18.5 μL、上下游引物各 0.5 μL(20 μM)、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs(10 mM) 0.5 μL、TaqDNA 0.5 μL、cDNA 2 μL.总体系25 μL，条件为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，1 min；72 ℃，3 min；72 ℃ 10 min；第2～4进行35个循环.反应结束，用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物.

1.5 表达载体pcDNA3.1-VCAM-1的构建及鉴定

VCAM-1扩增产物与pCDNA3.1(+)载体分别进行EcoRI、KpnI双酶切，胶回收纯化回收，并用T4 DNA连接酶进行连接.连接完成后，将连接产物转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养12～16 h.随机选取单克隆菌落进行增菌培养并进行测序，将获得测序正确的阳性质粒命名为pcDNA3.1-VCAM-1.

1.6 脂质体介导重组质粒pcDNA3.1-VCAM-1转染C2C12细胞

取已培养至密度约为75%的C2C12细胞培养板，用Opti-MEM漂洗细胞培养板中的细胞.Opti-MEM分别稀释重组质粒pcDNA3.1-VCAM-1及空载质粒pcDNA3.1.按比例加入脂质体LipofectamineTM2000混匀.逐滴加入C2C12细胞中，空白对照加入等量Opti-MEM，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育.孵育6 h后，弃去转染液，每孔分别加入3 mL含10% NBS的DMEM细胞培养液培养.

1.7 VCAM-1基因在C2C12细胞中转录检测

转染48 h后，各组弃去细胞上清，用预冷的PBS漂洗细胞两遍，之后用预冷的PBS将细胞吹打下来并收集在离心管中，1 000 r/min离心10 min，收集细胞沉淀.取收集的细胞提取总RNA，分别测定RNA的浓度及纯度.根据测定结果进行定量反转录，反转录得到的cDNA作为模板进行荧光定量PCR检测，目的基因为VCAM-1，内参基因为mGAPDH.反应体系：Power SYBR Green PCR Master Mix，2.5 μL；DEPC H2O，18.5 μL；VCAM-1-qF/mGAPDH-qF，1 μL；VCAM-1-qR/mGAPDH-qR，1 μL；cDNA，2 μL.反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，35 s；第2～3步骤重复40次.将所得数据进行统计学分析，比较各组间差异.

1.8 Western-Blot检测VCAM-1蛋白表达情况

运用1.7的方法收集细胞，用RIPA裂解液裂解后进行SDS-PAGE，在低温、60 V恒压条件转印到PVDF膜上.取出PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，加入一抗，37 ℃摇床孵育2 h，PBST洗5次，5 min/次；再加入二抗，37 ℃摇床孵育1 h，PBST洗5次，进行ECL显色.一抗分别为1∶2000稀释的兔抗VCAM-1单克隆抗体和1∶4000稀释的鼠抗β-actin，二抗分别为1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗兔和山羊抗鼠.

1.9 间接免疫荧光法检测VCAM-1基因细胞定位

重复步骤1.6，转染24 h后，弃去原培养基；PBS洗3次，每次5 min；加入80 g/L预冷丙酮1 mL/孔，固定15 min；弃去，晾干，加入0.1 mL/L TritonX-100对细胞透化处理15 min；PBS洗3次，每次5 min，用50 g/L牛血清白蛋白于37 ℃封闭90 min；加入1∶200稀释的兔抗VCAM-1单克隆抗体，37 ℃孵育1 h；PBS洗5次，每次5 min；再加入1∶500稀释的山羊抗兔IgG-Alexa Fluor®594，37 ℃避光孵育1 h；避光条件下PBS洗5次，每次5 min；DAPI染色液复染核10～15min；蒸馏水洗10 min；加入抗荧光猝灭的封片液封片，在尼康激光共聚焦显微镜下并拍照.

2 结果与分析

2.1 VCAM-1基因的扩增与酶切、测序验证

PCR扩增VCAM-1基因后进行核酸电泳验证，检测到片段大小与预期一致的特异性条带(图1，A)；表达载体pCDNA3.1-VCAM-1构建成功后，双酶切得到了目的基因与表达载体，大小与预期一致(图1，B).重组载体pCDNA3.1-VCAM-1由上海生工测序，核苷酸和氨基酸序列同源性均为100%，表明表达载体构建成功.

M：1kb plus DNA分子质量标准；1，2：VCAM-1基因PCR产物；3：PCR阴性对照；4，5：重组质粒pcDNA3.1-VCAM-1酶切产物

2.2 VCAM-1基因在C2C12细胞中转录检测结果

实时荧光定量PCR检测VCAM-1基因水平表达与统计学分析，转染pCDNA3.1-VCAM-1组基因丰度明显高于对照组，差异显著(P<0.01)，见图2，表明重组质粒转成功，并进行转录.

图2实时荧光定量PCR检测VCAM-1基因在C2C12细胞中的转录结果(P<0.01)

2.3 VCAM-1基因在C2C12细胞中蛋白水平的检测

经Western blot检测，VCAM-1在细胞量一致的情况下(内参调控)，转染pCDNA3.1-VCAM-1组蛋白的表达量明显高于对照组，见图3，表明VCAM-1成功过表达.

图3VCAM-1蛋白在C2C12细胞中表达产物Western-blot分析

2.4 VCAM-1基因在细胞过表达定位

间接免疫荧光实验检测结果，见图1.VCAM-1均在细胞浆中表达，且转染pCDNA3.1-VCAM-1组 明显要高于对照组，表明转染组VCAM-1蛋白获得了过表达，且与细胞中原有的蛋白共定位于胞浆内.

3 分析讨论

本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-VCAM-1，并在C2C12细胞中进行了表达.通过相对荧光定量PCR检测发现，VCAM-1过表达组基因水平明显高于对照组.通过Western-blot分析，过表达组VCAM-1蛋白高于对照组细胞.利用间接免疫荧光实验分析可知,在C2C12细胞上VCAM-1本底表达较低，当转染了真核表达载体pcDNA3.1-VCAM-1后，VCAM-1的表达明显增多，且共定位于胞浆中.结果证明，转染后基因水平及蛋白水平均有明显表达，成功建立了VCAM-1瞬时过表达的方法.

VCAM-1被鉴定为EMCV-D 在鼠类血管内皮细胞上的受体，且与白细胞整联蛋白结合触发信号级联反应.在炎症过程中，细胞因子在内皮细胞上诱导VCAM-1表达，细胞因子信号激活NF-κB通路.VCAM-1在病毒感染、炎性反应及天然免疫研究中具有较为重要的作用.VCAM-1瞬时过表达方法的成功建立，为深入研究EMCV病毒受体奠定了基础.

图4 VCAM-1蛋白在C2C12细胞中的过表达定位