超高效液相色谱-串联质谱法研究噻虫嗪在双孢蘑菇中的残留动态及安全性评估

张 栩，王伟民，董茂锋，温广月，刘福光

(上海市农业科学院农药安全评价研究中心，上海 201106)

噻虫嗪是一种全新结构的第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，对害虫具有胃毒、触杀及内吸活性，可有效防治各种蚜虫、叶蝉、飞虱类、粉虱、线虫、潜夜蛾以及多种地下害虫，并且与吡虫啉、啶虫脒等农药无交互抗性，被广泛用于农作物茎叶处理、种子处理和土壤处理等。噻虫嗪可选择性抑制昆虫中枢神经系统烟酸乙酰胆碱酯酶受体，进而阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，使害虫麻痹及死亡，对水生生物、鸟禽、土壤微生物基本无毒。但有证据显示，新烟碱类农药对蜜蜂等授粉昆虫生存造成威胁，并导致蜜蜂种群数量和聚居地减少[1]。随着欧盟在2013年5月对3种新烟碱类种子处理农药采取限制使用法规的实施[2]，噻虫嗪农药使用的健康风险和生态安全性问题受到了越来越多的关注。

双孢蘑菇(Agaricusbisporus)又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，有“世界菇”之称，其菌丝还可作为制药的原料。双孢蘑菇在中国被广泛栽培，栽培方式有菇房栽培、大棚架式栽培和大棚畦栽等。不同地区、不同气候条件和不同季节可采取适合的栽培方式，在培育中主要使用吡虫啉、噻虫嗪等农药进行害虫防治。

目前，对噻虫嗪残留行为的研究主要集中于噻虫嗪在蔬菜、水果及土壤中的残留上[3-7]，而对噻虫嗪在食用菌中残留的研究很少。对噻虫嗪残留的检测方法主要有毛细管电泳[8]、液相色谱[9]、液质联用[10-11]等，这些方法提取、净化步骤较多，比较繁琐费时，消耗有机溶剂。本试验拟采用乙腈溶解和分散固相萃取净化的方法，一步完成噻虫嗪的提取净化，并与超高效液相色谱串联质谱法 (ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS)配合检测，减少溶剂使用量，以建立一种简单且灵敏的方法测定双孢蘑菇和土壤中噻虫嗪的残留。同时，研究在双孢蘑菇栽培中使用25%噻虫嗪水分散粒剂后，子实体中噻虫嗪残留动态和最终残留，评估噻虫嗪残留的安全性，为今后噻虫嗪在食用菌栽培中的合理使用以及制定噻虫嗪在双孢蘑菇中最大残留限量(maximum residue limit，MRL)提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料1.1 供试菌株及培养料

双孢蘑菇1640菌种由上海市农业科学院食用菌研究所提供。

培养料：选择无农药污染的供试培养料，试验前检测农药残留。稻草2 500 kg、菜籽饼200 kg、尿素25 kg、硫酸铵25 kg、过磷酸钙50 kg、石膏62.5 kg、石灰75 kg。

1.2 主要药剂与仪器

25%噻虫嗪水分散粒剂(东莞市瑞德丰生物科技有限公司)；噻虫嗪标样(100 mgL)，上海市农药研究所有限公司提供。甲醇(色谱纯，美国Merck公司)；乙腈(色谱纯，美国Merck公司公司)；无水硫酸镁MgSO4(分析纯)；N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂：粒径40—60 μm；十八烷基硅烷(ODS)键合相吸附剂(C18)：粒径40—60 μm。 LC-8030高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾离子源，LC-MS 8030,日本岛津公司)；EC-C18色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.7 μm,美国Agilent公司)；超声仪(中国Dragonlab公司)；离心机(Thermo-Fisher)。

1.2 双孢蘑菇田间试验

1.2.1 双孢蘑菇栽培方法

试验在上海市青浦区食用菌基地进行，双孢蘑菇采用棚架覆土栽培，培养料经过二次发酵后施用。栽培方法参照李可等[12-13]，小区面积30 m2。

1.2.2 消解试验样品制备

1.2.3 最终残留试验样品制备

1.3 分析检测方法

1.3.1 样品提取与净化

称取5.00 g试样于50 mL聚乙烯离心管中，加入20 mL乙腈溶液，分别涡旋提取和超声提取5 min；再加入2—3 g氯化钠，涡旋0.5 min,4 000 rmin离心5 min后，取1 mL上清液至分别称有50 mg PSA、150 mg MgSO4、50 mg C18的2 mL离心管中；将离心管涡旋1 min，10 000 rmin离心2 min；取上清夜过0.2 μm有机相滤膜过滤，待测。

1.3.2 仪器检测条件

1.3.2.1 液相色谱条件

1.3.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源 ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：3.00 kV；锥孔电压：噻虫嗪20 V；噻虫胺16 V；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃；氮吹气流量：800 Lh；锥孔气流量：50 Lh；检测方式：多重反应监测。

1.3.3 标准曲线制作

1.3.4 添加回收率与检出限测定方法

1.4 安全性风险评估

农药的膳食暴露和风险评估常采用食品中农药残留量乘以该食品的消费量，求得农药残留摄入量与风险评估参照剂量(ADI或ARfD)的比较值农药膳食风险墒值RQ(risk quotient)评估[14]，计算公式如下：

RQ=∑[STMRi×Fi]×100[ARfD(ADI)×BW]

(1)

式中：STMRi为第i类初级食用农产品的规范试验残留中值,单位 mgkg；Fi(food consumption)为第i类食用农产品的消费量,单位 mgd；BW(body weight)为人群平均体重,单位 kg；ARfD(acute reference dose)为急性参考剂量,单位 mg(kg·BW)；ADI(acceptable daily intake)为每日允许摄入量,单位mg(kg·BW)。

当RQ≤1 时，表示其急性风险为可接受，RQ越小，风险越小；当RQ>1 时，表示不可接受。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

噻虫嗪标准品甲醇混合标准溶液标准曲线如图1。噻虫嗪标准曲线方程为：y= 1E+07x-51 846，相关系数R2=0.9993。

2.2 添加回收率与检出限

三种浓度的噻虫嗪平均回收率分别为89%、102%、103%，相对标准偏差RSD为8%、6%、7%，在农药残留分析允许范围之内。双孢蘑菇中噻虫嗪农药的最低检出限为0.01 mgkg。

2.3 残留消解动态

试验结果表明，噻虫嗪消解动态按制剂量0.075 g a.i.m2施药后，在双孢蘑菇中的降解基本符合一级指数降解曲线y=0.3875e-0.123x,R2=0.9164(图2)。随着时间的推移，残留量持续减少，施药后第5天，噻虫嗪残留减少36%以上，施药后第7天，噻虫嗪降解率达到了60%以上,施药后第14天，降解率达到了80%以上。根据一级指数降阶曲线计算，噻虫嗪在双孢蘑菇中的平均半衰期为6.3 d。

图1 噻虫嗪标准曲线Fig.1 The standard curve of thiamethoxam

图2 双孢蘑菇中噻虫嗪残留的降解动态Fig.2 The degradation dynamis of thiamethoxam residuesin Agaricus bisporus

2.4 噻虫嗪在双孢蘑菇中的最终残留量

末次施药后7 d、10 d、14 d时噻虫嗪在双孢蘑菇中的最终残留量为0.038—0.423 mgkg。我国尚未制定噻虫嗪在双孢蘑菇中的最大残留限量MRL值，本试验推荐噻虫嗪在双孢蘑菇中的MRL值为0.5 mgkg，安全间隔期为7d。

表1 噻虫嗪在双孢蘑菇中的最终残留量

2.5 最终残留量的长期膳食摄入和慢性风险评估

规范残留试验双孢蘑菇中噻虫嗪的残留中值是0.423 mgkg 。我国《食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2016)中制定噻虫嗪的ADI值为0.02 mg(kg·BW)[15]。参照2016版《中国居民膳食指南》，我国人均膳食结构中浅色蔬菜的每日摄人量，成年人一般为150—250 g，我国居民的平均体重为63 kg。根据1.4中公式计算普通人群噻虫嗪的每日摄入量为0.0001679 mg(kg·BW)，占日允许摄入量的0.8%左右，风险商值RQ小于1，认为该农药残留对一般人群健康的影响在一个可接受的风险水平。

3 结论

噻虫嗪是一种全新结构的第二代烟碱类农药，可防治双孢蘑菇中蚊蝇类和蚜类等害虫，具有更高的活性、更好的安全性、更广的杀虫谱及作用速度快、持效期长等特点，是有机磷类和有机氯类农药较好的替代品。本试验采用乙腈溶解和分散固相萃取净化的方法,结合超高效液相色谱-串联质谱法测定双孢蘑菇中噻虫嗪残留含量，在0.01—0.10 mgkg添加范围内，平均回收率均大于89%，相对标准偏差均小于8%，符合农药残留试验准则的要求。噻虫嗪消解动态按制剂量0.075 g a.i.m2施药后，噻虫嗪在双孢蘑菇中的平均半衰期为6.3 d。本试验研究了不同采收间隔期7 d、10 d、14d时噻虫嗪在双孢蘑菇中的最终残留量，残留范围为0.038—0.423 mgkg。噻虫嗪在双孢蘑菇中的MRL值我国尚未制定，根据试验检测结果，推荐噻虫嗪在双孢蘑菇中的MRL值为0.5 mgkg，安全间隔期为7d。

本研究显示，根据试验中噻虫嗪的残留中值计算普通人群噻虫嗪的每日摄入量为0.0001679 mg(kg·BW)，占日允许摄入量的0.8%左右,认为该农药残留对一般人群健康的影响在一个可接受的风险水平。由于膳食摄入风险评估还存在一些不确定的因素，蘑菇中噻虫嗪的应用没有登记资料数据，我国也没有国家最大残留限量MRL标准，因此，其膳食风险性还需进一步确定。