药桑叶中活性物质的提取及对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

郝蒙蒙，崔汉钊，韩爱芝，杨 玲*

（塔里木大学生命科学学院，塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

药桑在植物分类学上属桑科、桑属、黑桑种（Morus nigra L.）[1]，由于新疆南部生态环境独特，日照时间长、昼夜温差大、干旱[2]，使药桑成为具有体细胞染色体倍性为自然22倍体（2n＝22x＝308）的稀贵桑树资源[3]，目前主要分布于新疆阿克苏、和田和喀什等地区，是新疆地区在全国独一无二的桑种质资源[4]。现代药理学及化学成分研究表明桑叶具有降血糖、抗氧化、抗病毒等多种药理活性，其中生物碱以及黄酮类物质是桑叶中主要的降血糖活性成分[5]。俞灵莺等报道给糖尿病大鼠灌胃桑叶总黄酮后，大鼠血糖浓度由18.4 mmol/L降至10.2 mmol/L（P＜0.001），降糖作用显著[6]。陈建国等指出：桑叶多糖具有调节糖代谢、降低血糖、改善糖尿病症状的作用[7]。1976年Yagi等初次从桑树中分离得到生物碱成分[8]。买买提依明等曾对药桑叶片中的生物碱成分进行检测，发现其主要成分为1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ），含量为1.893 3 mg/g[9]。此外，有研究表明，桑叶总黄酮也能够抑制双糖酶活性，从而具有显著的降血糖作用[10]。而且将类黄酮与DNJ结合能更有效地抑制血糖上升，表明类黄酮与桑叶DNJ有一定的协同作用[11]。而中南大学湘雅医学院生理学系对一种以桑叶为主要原料的降血糖保健品进行研究，也发现桑叶多糖、生物碱及产品中其他成分有一定的协同配伍作用[12]，以上研究均是采用的随机浓度组合方法来研究不同物质之间的协同作用，但如何定量分析各成分之间的协同、相加或拮抗作用并未采用统计学方法。目前普遍用Chou-Talalay（又称中位药效法）数学模型来评价药物协同作用效果[13]，目前针对Chou-Talalay的数学模型开发出的第3代药物联合作用剂量-效应分析软件“CompuSyn”是被广泛认可的药物协同作用定量分析方法[14]，该公式主要用联合指数（combination index，CI）来定量描述药物之间的相互关系[15]。

本研究以新疆特色药桑桑叶为材料，在本实验室已建立的集成提取工艺基础上，通过适当优化，获得化学成分和含量基本稳定、具有降血糖活性的生物碱、黄酮和多糖的粗提物[16]；并以此为实验药物来研究其抑制α-葡萄糖苷酶的抑制作用，进一步采用CompuSyn软件对具有活性的稳定粗提物做统计学分析，来判断桑叶中多糖、黄酮、生物碱是否具有协同作用，旨在为更深入研究和开发新疆药桑桑叶的药用和经济价值提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

药桑叶2016年7月采集于新疆库车地区，经塔里木大学邱爱军副教授鉴定为药桑（Morus nigra L.）叶，药桑叶粉碎后避光置于干燥处保存。

芦丁 美国Merck公司；葡萄糖 上海山浦化工有限公司；4-羟基哌啶 西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG） 上海如吉生物科技发展有限公司；阿卡波糖片 德国拜耳医药有限公司；α-葡萄糖苷酶 江苏瑞阳生物科技有限公司；所有分离纯化用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-5205旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；CP224C电子天平 美国奥豪斯仪器有限公司；HH-2恒温水浴锅 上海爱朗仪器有限公司；恒温干燥箱 上海嘉颖科技有限公司；Infinite M200 Pro多功能酶标仪瑞士Tecan公司；S54紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑叶中主要活性物质的提取及纯化

准确称取干燥药桑叶粉末300.0 g，按料液比1∶20加入6.0 L石油醚，70 ℃回流4 h，过滤，滤渣按料液比1∶20加入6.0 L体积分数65%乙醇溶液，浸泡24 h，过滤，滤液减压浓缩得桑叶浸膏；桑叶浸膏经过树脂分离纯化，分别得到生物碱、黄酮和多糖的3 种粗提物，集成提取工艺流程如图1所示。本实验重复3 次，分别测定粗提物中主要成分的含量。黄酮含量测定采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[17]，以芦丁为标准品，制作标准曲线Y＝11.64X-0.001 2，R2＝0.999 7；生物碱含量测定采用雷氏盐比色法[18]，以4-羟基哌啶为标准品，制作标准曲线Y＝0.169 5X+0.090 7，R2＝0.990 3；多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[19]，葡萄糖作标准品，制作标准曲线Y＝7.170 6X-0.005 2，R2＝0.991 7；分别以以上3 种方法测定桑叶浸膏、粗生物碱、粗黄酮、粗多糖中黄酮、多糖、生物碱的含量，实验重复3 次，确定工艺稳定性。

图 1 集成提取工艺流程图Fig. 1 Flow chart for the synchronous extraction of active substances from mulberry leaves

1.3.2 α-葡萄糖苷酶降血糖活性测定

α-葡萄糖苷酶与其底物PNPG发生反应，生成对硝基苯（p-nitrophenyl，PNP），PNP在碱性环境下显黄色，在400 nm左右波长处有最大吸收，在一定的质量浓度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）范围内，PNP的吸光度与α-葡萄糖苷酶活力成正比[20]。

本实验在96微孔板中测定完成[21]，实验共设置3组，每组3 个重复，依次为：空白组（酶液+底物）、样品组（样品+酶液+底物）、背景组（样品+底物），实验以阿卡波糖作阳性对照[22]，具体反应体系为：磷酸盐缓冲液：空白组96 μL、实验组80 μL、背景组96 μL；样品：空白组0 μL、实验组16 μL、背景组16 μL；α-葡萄糖苷酶：空白组16 μL、实验组16 μL、背景组0 μL；PNPG：空白组16 μL、实验组16 μL、背景组16 μL；Na2CO3：空白组100 μL、实验组100 μL、背景组100 μL。

抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（1）计算。

式中：A0为空白组吸光度；A1为样品背景组吸光度；A2为样品组吸光度。

1.4 数据处理

根据CompuSyn软件需求，以半数有效剂量Dm为中心设计5 个质量浓度梯度（表1），并测定不同质量浓度下相应抑制率fa[23]，采用CompuSyn统计软件，根据中效方程式（式（2））、CI一般式（式（3））、两个药物CI（式（4）），用设计的质量浓度和测得的相对应质量浓度下的抑制率绘制剂量-效应曲线（C-fa）及不同效应下的CI曲线（fa-CI）[24]，从两供试样品联合的效应与CI的关系图定量评价供试样品间的相互作用的强度以及性质[25]，CI＝1，为相加效应；CI＞1，为拮抗效应；CI＜1，为协同效应[26]。

式中：fa为抑制率；fu为存活率，fu＝1-fa；D为单用剂量/（mg/mL）；Dm为半数有效剂量/（mg/mL）[27]；m为中效曲线的斜率；Dx为联用剂量/（mg/mL）[28]；CI为联合指数。

表 1 药物质量浓度Table 1 Drug concentration

2 结果与分析

2.1 3 种粗提物中活性成分含量分析

表 2 各项粗提物中活性成分含量重现性实验结果Table 2 Reproducibility of bioactive ingredients in crude extracts

由表2可知，各项中黄酮、生物碱、多糖含量相对偏差均满足要求，说明各项中主要活性成分含量稳定，具有重现性，粗生物碱中黄酮含量及粗多糖中生物碱含量甚微，无法测出；且经过纯化，粗黄酮中黄酮含量最高，粗多糖中多糖含量最高，粗生物碱中生物碱含量最高，相比桑叶浸膏相含量明显增加，在其他相中明显降低，说明纯化效果明显。

以上重复性实验结果表明：桑叶粗黄酮、粗多糖、粗生物碱中3 种主要成分黄酮、生物碱、多糖含量均是稳定的，且具有重复性，说明该提取纯化工艺稳定，得到的提取物中主要成分含量稳定。3 种提取物能够作为降血糖活性实验的药物原料。

2.2 3 种提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

2.2.1 单一活性物质对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

实验以阿卡波糖作阳性对照，在0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 5 个质量浓度下，分别测定了生物碱相和黄酮相对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以活性物质质量浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制率曲线，如图2所示。

图 2 单一活性物质对α-葡萄糖苷酶的抑制Fig. 2 Inhibitory effect of single bioactive substances on α-glycosidase

由图2可知，在0.4～1.2 mg/mL的质量浓度范围内阿卡波糖、黄酮及生物碱都与α-葡萄糖苷酶抑制作用呈良好的线性关系，随着质量浓度的增加，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用也逐渐增强，且在同等质量浓度作用下，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用：生物碱＞阿卡波糖＞黄酮。在质量浓度为1.2 mg/mL时，生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到73.87%，表明桑叶中生物碱具有更好的降血糖活性；多糖在高质量浓度作用下具有一定的降血糖活性，其半数有效剂量约为生物碱半数有效剂量的15 倍，差异太大，因此在图中未给出。

2.2.2 3 种主要活性物质及其相互组合物的软件分析结果

表 3 不同单药及合用时半数有效剂量、斜率和相关系数值Table 3 Values of Dm, m and r for bioactive substances alone and in combination

由表3可知，3 种单药及不同药物相互组合时r均大于0.95，表明活性物质的剂量与效应之间拥有良好的线性关系；Dm表示各活性物质的半数有效剂量，在本实验中即各物质的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）；Dm、m由CompuSyn软件根据中效方程（式（2））自动模拟计算。

2.2.3 不同活性物质之间相互组合对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

分别测定单药在5 个不同质量浓度下单用或与其他单药平行联合作用下的抑制效应，结果如图3所示。

图 3 药物单用及合用剂量-效应图及联合作用指数曲线图（fa-CI）Fig. 3 Dose-effect and fa-CI curves of bioactive substances individually and in combination

由图3可知，不同质量浓度单药及平行质量浓度下两两联合的抑制效应均呈现剂量依赖关系；根据Chou-Talalay CI法可分别得到不同组合物之间联用的CI曲线。由图3可知，多糖+生物碱的组合与黄酮+生物碱的组合，在0＜fa＜1时，CI均大于1，表明两者之间相互拮抗；多糖+黄酮的组合在fa不小于0.90时，CI＜1，两者之间具有协同作用；生物碱+多糖+黄酮三者之间相互作用在fa不小于0.95时，CI＜1，三者之间具有协同作用，综上所述，生物碱+黄酮及生物碱+多糖两个组合对α-葡萄糖苷酶的抑制具有拮抗作用，多糖+黄酮及黄酮+生物碱+多糖三者组合这两组组合在高的质量浓度作用下对α-葡萄糖苷酶的抑制具有一定的协同作用。

3 讨 论

获得稳定的提取物是本实验的关键，在本实验室已建立的集成提取工艺基础上，对提取流程进行了改进，先采用石油醚进行脱色脱脂，再用乙醇提取，用此流程提取的活性物质的化学成分和含量稳定，具有重复性，保证了α-葡萄糖降血糖活性实验中药物原料的可靠性。

目前主要的α-葡萄糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，这些药物都存在胃肠不适等副作用。而桑叶作为降血糖的常用中药之一，是潜在的安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂[30]。

本实验以α-葡萄糖苷酶为研究对象，作用于反应底物4-硝基酚-α-葡萄糖苷，释放出一定量的葡萄糖；当有α-葡萄糖苷酶抑制剂存在，可以抑制这一反应，使最大吸收峰值下降，其下降程度与抑制剂活性呈正比。基于此作用原理和作用特点，评价桑叶中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多组分相互作用并探讨其剂量-效应关系。

CompuSyn软件作为分析药物相互作用的方法，是评价剂量-效应变化的有力工具。本实验采用3 种药物相互作用的评价方法探讨桑叶不同组分配伍组合对α-葡萄糖苷酶抑制活性的剂量-效应变化与效应关系，研究表明，桑叶中降低血糖的主要有效成分包括黄酮类、生物碱类、多糖类3 类功效成分，在本实验室所用的质量浓度范围和剂量配比内，其中粗生物碱的降血糖作用优于粗黄酮，粗黄酮的降血糖作用优于粗多糖，且生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制作用比阳性对照（阿卡波糖）更好，在本实验室所用的质量浓度范围和剂量配比内，黄酮+生物碱组合、多糖+生物碱组合作用时，CI＞1表现为拮抗作用，黄酮+多糖在0＜fa≤0.9时，CI＞1表现为拮抗作用，在0.90＜fa≤1时，CI＜1表现为协同作用；黄酮+多糖+生物碱三者相互作用时，在0＜fa≤0.95时CI＞1，表现为拮抗作用，在0.95＜fa≤1时，CI＜1，两者之间表现为协同作用。上述结果显示桑叶的活性物质之间，在高质量浓度作用下，表现为较好的协同作用，为揭示桑叶整体调节血糖作用提供了科学依据。

药桑由于其产地独特的地理位置，在生物活性及药理作用方面有着独特的特性，因此对药桑降血糖作用的研究应做更深的分析，不能仅仅做抑制α-葡萄糖苷酶的协同或拮抗作用，需要更多的实验数据来支持桑叶的降血糖作用，本实验的下一步将进行体内降血糖活性实验，来进一步探讨药桑的降血糖活性。