植物提取物对畜禽肠道免疫的 影响及其调控机制
2018-10-29解玉怀王丽雪杨维仁张桂国张崇玉刘艳花张济福
解玉怀,王丽雪,杨维仁,张桂国,张崇玉,刘艳花,张济福
(1.山东农业大学动物科技学院 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,山东 泰安 271018; 2.胶州市畜牧兽医局,山东 青岛 266300)
肠道不仅是机体的食物消化和营养物质吸收的主要场所,也是机体表面积最大的免疫器官。肠道特异性免疫及粘膜屏障组成了肠道免疫系统,是机体第一道免疫防线的重要组成部分[1],也是病原微生物侵入机体最主要的位置。机体许多疾病的发生都是从肠道免疫屏障的破坏开始的,通过营养调控维持畜禽肠道免疫处于最佳水平是保证肠道健康、减少疾病和降低经济损失的重要手段。
肠道特异性免疫系统是由散布在肠粘膜上皮和固有层内的免疫细胞、免疫因子以及肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)、Peyer结(Peyer’s patch,PP)等组织构成[2];非特异性的肠道粘膜屏障则包括肠道上皮细胞间的物理屏障,粘膜化学屏障以及微生物屏障[3],二者共同构成了机体肠道免疫系统,保护着机体免受病原体的侵害。近年来的研究发现,植物提取物包括植物多糖、生物碱、植物多酚、黄酮、皂甙以及植物精油在内的多种成分,是具有重要生物功能的天然活性物质,不仅在畜禽生产性能改善、养分消化率提升方面有着显著作用,而且作为抗生素替代品,在机体免疫力提高、抗氧化、抗病毒等方面也发挥着多种药理功效[4],其开发利用对畜牧生产具有重要的意义。
1 肠道免疫系统概述
肠道免疫系统是由大量弥散分布在肠粘膜上皮和固有层内的免疫细胞、免疫因子、PP结等肠道相关性淋巴组织(gut-associated lymphatic tissue,GALT)以及非特异性粘膜屏障构成,它是组成机体免疫系统的重要部分,也是机体最大的淋巴器官,在维持机体肠道健康,抵抗病原入侵中起到重要作用。
1.1 肠道免疫系统的构成
肠道上皮免疫系统按照功能分为免疫诱导部位和效应部位。诱导部位主要为PP结,效应部位主要包括肠粘膜上皮内和固有层的淋巴细胞(图1)[2]。小肠PP结是小肠内淋巴滤泡的集合体,为高度器官化黏膜相关淋巴组织(mucosal-associated lymphoid tissue,MALT),主要由T、B淋巴细胞(CD4+)组成;滤泡表面覆盖一层滤泡相关上皮(follicle-associated epithelial cells,FAE),主要由肠道上皮细胞、淋巴细胞和特定的抗原转运细胞(微褶皱细胞,又称M细胞)构成,肠道上皮细胞与粘膜层构成了粘膜屏障。在PP结的淋巴滤泡中含有大量免疫细胞,受抗原刺激形成效应中心,B淋巴细胞及增殖淋巴母细胞主要聚集于此,并多数为IgA+细胞,滤泡间区含有少量IgM+和IgD+细胞。T、B淋巴细胞在此分化成熟,并移行到粘膜的相应位置发挥其免疫效应。
图1 肠道免疫系统Fig. 1 Intestinal immune system
该图基于文献[2-3]制作。
Fig. 1 was made referred to reference [2-3].
1.2 肠道特异性免疫
肠道特异性免疫分为体液免疫和细胞免疫。完整的免疫系统对细菌、病原体及有害抗原做出免疫排斥与清除工作。这其中参与免疫的主要效应细胞包括效应T细胞、效应B细胞、浆细胞、巨噬细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK),主要的辅助细胞主要有M细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)和巨噬细胞。
1.2.1体液免疫 体液免疫是肠道免疫的主要过程,即产生SIgA。此过程中,M细胞担任着免疫的门户,进入肠道的细菌、病毒等抗原首先被M细胞捕获,并转移给淋巴滤泡中集结的巨噬细胞。未清除的抗原被提交到上皮淋巴组织处,并激活淋巴组织内的T、B细胞,被激活的T、B细胞通过淋巴导管系统游离与粘膜结合的淋巴组织,通过胸导管进入血液循环,最后到达肠道固有层与相关腺体处。同时DC也能够到达上皮细胞处,具有较强的抗原捕获能力。肠道固有层是粘膜免疫的主要效应部位,B细胞定居于固有层,在抗原、细胞因子及辅助性T细胞(Th)的刺激下增殖分化为成熟的IgA浆细胞。浆细胞分泌的IgA通过J链链接的二聚体与分泌成分(SC)结合构成SIgA,分泌到粘膜表面,发挥着阻止病原体黏附或进入粘膜上皮、溶解细菌以及中和病毒等作用[5]。
1.2.2细胞免疫 粘膜固有层细胞包括上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)、T细胞、K细胞、巨噬细胞、NK等在内的固有层免疫细胞构成了肠道细胞免疫。IEL中90%是CD3+T细胞,其中CD4+T细胞包括诱导性T细胞(Ti)和Th细胞,主要起辅助与诱导的作用,占CD3+细胞的65%~80%。CD8+细胞,包括抑制性T细胞(Ts)和细胞毒性T细胞(Tc),其通过直接杀伤作用负责对靶细胞的清除,主要起着抑制和毒杀的作用。肠道粘膜中CD4+T细胞可促进IgA的合成,CD8+细胞起到抑制作用。同时T细胞分泌的细胞因子如IL-4、IL-13等对粘膜化学屏障,特别是黏液与黏蛋白的分泌起到促进作用[6]。
1.3 非特异性肠道粘膜免疫屏障
非特异性肠道粘膜免疫屏障是肠道免疫的天然屏障,主要包括肠道物理屏障、化学屏障和微生物屏障(图2)[3]。各个屏障通过不同的分子机制、信号通路及生物学功能,发挥着抵抗外来抗原与病原菌的黏附与入侵,对机体起到初步的免疫防御作用。
图2 肠道粘膜非特异性免疫屏障Fig. 2 Nonspecific immune barrier of gut mucosa
该图基于文献[3]制作。
Fig. 2 was made referred to reference [3].
1.3.1肠道粘膜物理屏障 物理屏障又称机械屏障,由肠粘膜上皮细胞及其间紧密连接组成的肠道上皮完整的结构组成,是肠道屏障中尤为重要的一部分。肠道上皮细胞紧密排列,通过细胞间连接复合体调控细胞旁路通透性和上皮屏障的完整性。这些链接复合体包括紧密连接(tight junction,TJ)、黏着连接(adherence junction,AJ)、桥粒(desmosome)和间隙连接(gap junction,GJ)等(图3)[7]。TJ是连接相邻细胞间的狭窄嵴线,是阻止肠腔毒素进入组织、封闭细胞间隙的重要结构,在调控上皮细胞旁路的流量速度上有一定作用,也是区分细胞刷状缘与基侧膜的标志[8];AJ位于紧密连接下方,在细胞间的黏附与胞内信号传递上起着作用[9];桥粒则起到链接相邻细胞的作用[10];GJ可在细胞间形成电偶联和代谢偶联,对神经冲动传递起作用,并连通细胞,形成胞间小分子代谢物和信号分子的水性通道。
图3 肠道上皮细胞中细胞间连接的分子结构Fig. 3 Molecular structure of the intercellular junction of intestinal epithelial cells
该图基于文献[7-9]制作。
Fig. 3 was made referred to reference [7-9].
TJ在免疫屏障中起重要作用,其通透性决定着整个肠道上皮屏障的功能。研究发现,TJ主要有3种整合蛋白,即闭锁蛋白(occluding)、闭合蛋白(claudin)和连接黏附分子(junctional adhesion molecule,JAM);前两者构成了TJ的主链,是多跨膜蛋白,主要负责相邻两个细胞间小分子物质扩散与通透性的调控;JAM在免疫监视和炎症反应期间,对免疫细胞的运输非常重要[11]。研究发现,claudin执行不同的功能,并且可以大致分为两类:涉及屏障形成(降低细胞旁路渗透性)和通道孔隙形成(增加细胞旁路渗透性)。在肠道中,claudin-1,-3,-4,-5,-8,-9,-11,-14与屏障的形成有关,claudin-2,-7,-12,-15与孔隙的形成有关[12]。Claudin封闭相邻两个细胞的间隙,而3个上皮细胞间屏障的连接则是由tricellulin蛋白来调控的,tricellulin基因表达的抑制影响了上皮屏障的完整性[13]。闭锁小带(zonula occludens,ZO)是TJ的特异性蛋白,是膜相关的鸟苷酸激酶同系物(membrane-associated guanylate kinase,MAGUK)家族的成员,ZO的特殊结构在TJ中提供了细胞内支架并起着调节和维持其结构的作用[11]。
1.3.2肠道粘膜化学屏障 肠粘膜化学屏障主要是指覆盖在肠上皮细胞的黏液层。黏液层是由肠黏液腺和上皮杯状细胞产生的,附着在粘膜表面一定厚度的疏水黏液被,其主要成分为黏蛋白(mucin,MUC)、SIgA、水、电解质,并伴有细胞碎片与常驻菌群。黏液被覆盖在粘膜表面,遮盖了粘膜表面的糖蛋白和糖脂受体,阻止了细菌的附着;黏液中的糖蛋白和糖脂则充当了细菌黏附受体的类似物,改变了细菌的进攻位点,使细菌结合到黏蛋白和糖脂上,并随粪便排出体外[14];同时黏液被保证了上皮细胞不受肠腔渗透压的影响。
MUC是一类高度糖基化的大分子黏蛋白,依其结构及分布可分为两类(图4):一类为经典的凝胶形成黏蛋白[gel-forming mucin,包括MUC2(肠黏蛋白)、MUC5AC、MUC5B和MUC6],主要形成巨大的聚合物;另一类为跨膜黏蛋白(transmembrane mucin,包括MUC1、MUC3、MUC4、MUC12、MUC13、MUC16和MUC17),覆盖于上皮细胞顶端表面,具有细胞质尾区和巨大胞外黏蛋白域,其分子质量在1 mu到10 mu以上(MUC13除外)[15]。
图4 肠道内两种不同类型的黏蛋白: 凝胶形成黏蛋白与跨膜黏蛋白Fig. 4 Two different types of intestinal mucins: Gel-forming and transmembrane mucins
该图基于文献[15]制作。
Fig. 4 was made referred to reference [15].
MUC2主要是由肠道内杯状细胞和少量上皮细胞分泌的黏蛋白组成,是构成肠黏液层主要成分,其形成的聚合物在100 mu以上。MUC2初始转录产物在高尔基体上通过二硫键形成二聚体[16],并装配O-聚糖链使分子质量达到5 mu左右,在产物外排的囊泡阶段中,二聚体的N-末端通过二硫键连接为三聚体(图5A)[15],一旦从细胞中释放后,MUC2分子便扩大,形成由二聚体C末端和三聚体N末端相连的网络结构(图5B)。同时MUC2中含有两个或多个CysD结构域,可通过非共价键形成非常稳定的非共价二聚体[17],使MUC2在高离子液盐中保持不溶性,因此,网状的外部结构配合共价键与非共价键的交联,使得MUC2构成的凝胶黏液层结构牢固并保持高度稳定性,起到有效保护上皮细胞,发挥屏障保护的作用。
1.3.3肠道粘膜微生物屏障 微生物屏障是肠道内正常菌群在肠道内定植形成的微生态系统。研究表明,肠道内厌氧菌能够通过磷壁酸与肠粘膜上皮细胞结合,可有效阻止致病菌的定植与入侵;厌氧菌不仅产生维生素等供机体利用,而且产生的乳酸和短链脂肪酸等还可降低肠道pH,抑制致病菌生长;其中,丁酸作为肠道上皮细胞的能量物质,对肠道上皮细胞的增殖与分化,以及肠道紧密连接的形成起着作用[18];同时常驻菌群多带有抗原性,可刺激特异性免疫系统的成熟,抵御病原菌入侵。
除此之外,肠道节律性的蠕动,使肠内容物不断向后推动,加之粘膜层的部分黏液夹杂脱落的上皮细胞碎片对病原菌的机械阻挡作用,使肠道粘膜非特异性免疫系统充分地发挥了阻挡病原菌入侵、保护内环境稳定的作用。
1.4 常用的反映肠道粘膜免疫屏障的指标
1.4.1肠道通透性 肠道通透性是指肠腔内分子质量在150 u以上的物质以非通道或载体介导的被动扩散的方式通过肠粘膜的能力[19]。肠道通透性是监测肠道免疫屏障功能的重要指标,其改变可以准确反映肠粘膜的损伤程度。肠粘膜通透性的增加,表明肠粘膜完整性受到破坏,肠道屏障功能受损。
图5 MUC2的结构Fig. 5 Structure of MUC2
该图基于文献[15]制作。
Fig. 5 was made referred to reference [15].
目前检测肠道通透性的方法主要有糖分子探针法、聚乙二醇类及同位素标记等方法,其中以非代谢性低聚糖的糖分子探针方法最为常用,其中又以双糖分子乳果糖/甘露糖(lactulose/mannitol,L/M)探针为代表。与其他糖分子探针相比,乳果糖和甘露醇的回收率较高,受肠道内渗透压影响较小,是比较理想的糖分子探针[20]。乳果糖是双糖分子,分子质量较大(Mr=342,直径0.92 nm), 通过肠粘膜上皮细胞间的紧密连接吸收,这也是细菌及内毒素进入体内的主要途径,因此,乳果糖的通透性反映了肠粘膜屏障的状态。甘露醇是单糖分子,分子质量较小(Mr=182,直径0.68 nm),主要通过肠粘膜上皮细胞的微孔吸收。而且这两个分子结果稳定,无毒,无免疫原性,在体内不代谢,以尿中等量原型排出。通过口服,检测吸收比可准确反映肠粘膜通透性及粘膜屏障功能。尿中L/M比值升高代表肠粘膜紧密连接部不完善,肠道通透性增大,肠粘膜屏障功能受损。近年来,由于气相和液相色谱法检测L/M比值较准确、快速,已被广泛应用[21]。
1.4.2二胺氧化酶 二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)是具有高度活性的细胞内酶,普遍存在于哺乳动物肠粘膜上皮绒毛中,以小肠中活性最高,而几乎不存在于其他组织或细胞中。生理状态下,血浆中DAO活性很低,当肠粘膜屏障完整性受损时,肠上皮释放大量DAO进入血液,或随坏死粘膜进入肠腔混入食糜中,因此,DAO活性能够反映肠粘膜屏障的完整性,是肠粘膜功能状态的敏感指标[22]。临床上通常通过测定血清、粘膜组织或肠道食糜中DAO活性,来反映肠粘膜屏障,特别是在无创条件下,血清中DAO活性更能直接地反映肠上皮细胞及肠道功能的完整性,是监测肠粘膜屏障损伤程度的重要指标。
2 常见植物提取物种类及其对肠道健康与免疫的调控功能
植物提取物是从植物的茎、叶或根中提取的天然活性物质,近年来在畜禽养殖中得到广泛应用,主要的活性成分包括多糖、植物精油、黄酮类、生物碱、皂甙、多酚类等物质。在生产中,发挥着改善生产性能,抗氧化、抗病毒,提高机体免疫力,预防畜禽疾病,改善肠道健康等重要的作用[23-24]。
其中,多糖类、多酚类、皂甙、精油及醇类提取物被证明有着显著改善机体肠道健康,提高肠道免疫的功能。其对肠道的改善作用主要包括:1)改善肠道环境,增强消化酶活性,提高消化机能;2)促进肠道形态发育,改善黏膜形态;3)调控肠道菌群,提升肠道屏障功能[25];4)维持肠道特异性免疫,提高免疫应答敏感度,消除肠道氧化损伤[26]。植物提取物对肠道具有营养和保健的双重功效,是肠道改善型抗生素的理想替代品。
近几年,植物提取物对肠道免疫的调控作用逐渐引起了人们的重视,并且在细胞及分子上的作用机制也逐渐被探索。目前发现的作用机制主要包括:1)提高肠道特异性免疫系统,通过识别免疫细胞特异性膜受体,激活免疫应答,消除炎症,保护肠上皮细胞[27];2)维持肠道黏膜完整性,激活肠上皮细胞物理屏障相关信号通路,阻止病原菌入侵[28];3)增加肠道黏蛋白分泌,提高防御能力[29];4)调控肠道菌群,促进SIgA分泌,清除病原菌[2];5)提高养分消化率,降低肠道有害代谢产物如尿酸、尿素氮的含量,维持肠道健康。
3 植物提取物对肠道粘膜关键蛋白表达调控机制
3.1 对TJ的调控通路
TJ结构的组装、分解和维持受到各种病理性和病原性刺激物的影响,TJ的调节,以及细胞膜蛋白与肌动蛋白之间的交互作用主要受到以下几个信号通路的影响:蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs),肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)以及Rho家族的GTP酶[30]。
TJ的磷酸化作用影响到上皮屏障的功能,同时claudin蛋白的磷酸化影响到TJ渗透性的升降,而且研究发现,occludin也通过磷酸化作用与TJ相联系[31]。在上皮细胞内,PKC是一个重要的蛋白,其不同的亚型介导了多种信号转导通路[32]。TLR2(Toll-like receptor 2)是重要的微生物识别与免疫调节相关蛋白,在上皮细胞中,对TLR2的刺激激活了PKCα与PKCδ蛋白,继而增加了跨上皮细胞电阻(trans epithelial electrical resistance,TEER)和ZO-1的重新分配[33]。MAPK可对各种刺激或生长因子做出响应,其中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)可直接作用于occludin蛋白的C-末端阻止过氧化氢诱导的TJ的断裂[34],白藜芦醇能够活化PKC,增加MAPK的基因表达水平,促进Caco-2细胞TJ相关基因和蛋白 (claudin-1,occludin和ZO-1)的表达[35]。
MLCK是介导调控TJ渗透性多条通路的关键的中间元件,例如影响TJ屏障的细胞因子、菌群等。肌球蛋白环的收缩很大程度上是由MLCK磷酸化后的肌球蛋白Ⅱ调节轻链 (myosin Ⅱ regulatory light chain,MLC) 所调控,进而影响TJ的组装和调控。Shen等[36]发现,在Caco-2细胞系中,诱导型启动子控制的MLCK突变体的连续表达,导致了TEER的降低与ZO-1和occludin的重新分配。中药提取物亦能够提高Caco-2细胞的TEER,降低细胞通透性,并可调节claudin-2保护Caco-2细胞的功能[37]。
Rho GTP酶介导的TJ调控通路比较复杂,Rho的失活导致ZO-1与occludin背离细胞膜,以及F肌动蛋白(F-actin)功能的重组,进而导致TEER的降低与细胞旁路通量的增加[38]。然而Rho的激活会使MLC磷酸化,诱导肌动蛋白环的收缩,进而增加了TJ的分解。植物提取物中的低聚糖能够通过Rho相关激酶增强上皮细胞TJ功能的恢复[39]。
当肠道炎症发生时,TJ会受到影响。对于LPS诱导的损伤,黄芪苷与黄芪(Astragaluslinn)多糖均被证实具有缓解损伤的作用,能够显著提高ZO-1与occludin的mRNA水平,上调ZO-1的蛋白表达,并可恢复LPS造成的ZO-1的连接与分布[28,40];从刺五加(Acanthopanaxsenticosus)中提取的多糖在维持occludin,ZO-1蛋白的重新分配与表达上发挥重要作用,并可通过抑制NF-κB/MLCK通路的激活,促进F-actin的磷酸化[41]。
3.2 对MUC2的调控通路
MUC2是肠道杯状细胞产生的分泌型糖蛋白,是肠上皮黏液的主要成分,有着保护肠上皮的功能,然而,其在免疫反应中的调节机制尚未完全清楚。包括MUC2在内的肠道黏蛋白主要受到副交感神经的控制;在结肠癌细胞中,IL-4、IL-13或TNF-α则能够通过特定的信号通路MAPK激活MUC2的mRNA表达[6]。
肠上皮细胞能够通过TLR与NLR(NOD-like receptor)信号通路直接对病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)做出响应,导致黏蛋白基因表达的改变[42]。肠道炎症发生时,巴西人参(Pfaffiapaniculata)提取物能够刺激粘膜上皮细胞,增加MUC3和MUC4的分泌水平,缓解肠炎[43]。
肿瘤抑制基因p53是人类恶性肿瘤中频繁突变的基因,p53蛋白是转录因子,调节参与细胞周期进程,DNA修复、凋亡等许多生长控制基因的表达[44]。研究证实,MUC2基因的启动受到p53蛋白的转录调节,细胞应激可能通过p53产生MUC2促进受损细胞周围保护屏障的构建[45]。植物中的活性成分,如茶多酚、黄酮能够通过p53转录激活MUC2基因表达[46]。
MUC2等黏蛋白的表达还受到其他植物成分的影响,饲喂灵芝(Ganoderma)水提物(主要功能成分为多酚)能够显著提高大鼠排泄物中MUC含量,起到改善肠道免疫和屏障功能的作用[29]。肉仔鸡日粮中添加丹参精油后,回肠MUC及杯状细胞的数量显著提高[47];姜黄(Curcumalonga)、百里香(Thymus)和肉桂(Cinnamomumcassia)提取物也被证实具有增加肉鸡小肠MUC2基因表达和改善肠道消化和防御能力的作用[48]。
4 植物提取物对其他肠道主要免疫指标的影响
4.1 调控细胞因子分泌,维持肠道免疫
细胞因子是多种免疫细胞应答炎症反应时释放的一类非抗体、非补体的能够调节免疫功能,调节细胞生长分化,参与炎症反应的小分子多肽物质[49]。而在肠道免疫中,细胞因子对肠道粘膜特异性免疫和非特异性免疫屏障起着不同的功能,这源于细胞类型的不同。
在肠道特异性免疫中IFN-γ、IL-2、IL-4等细胞因子具有特殊且重要的意义。IFN-γ主要由Th1细胞分泌,参与诱导和增强机体的细胞免疫;IL-4是由Th2细胞分泌,参与促进B淋巴细胞的增殖分化,增强体液免疫[50]。Th1、Th2细胞的稳定对维持肠道免疫功能至关重要,IFN-γ、IL-4的水平则体现出Th1与Th2细胞的活性,反映肠道细胞免疫与体液免疫的状态。IL-2对免疫反应的性质有着显著影响,有利于Th1和Th2细胞的免疫应答。从枸杞(Luoiumbargarum)与茯苓(Poriacocos)中提取的多糖能够提高免疫抑制下小鼠肠道粘膜中IFN-γ和IL-4的分泌水平,维持肠道免疫处于相对稳定状态[51]。转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是肠道内诱导粘膜SIgA的重要物质,在体外,TGF-β能够诱导同型IgA向SIgA的转化,而敲除TGF-β基因或缺失TGF-β受体的小鼠IgA响应受到抑制[52]。Xie等[53]发现口服白术(Atractylodismacrocephalae)多糖可显著(P<0.05)提高小鼠十二指肠中TGF-β和IL-6和TNF-α的mRNA的表达量。IL-17是促使白细胞处理炎症的重要细胞因子,能够诱导上皮细胞、T细胞产生趋化因子,从淫羊藿提取的多糖可促进小肠IL-17分泌,提高肠道免疫[54]。
在肠道非特异性粘膜免疫屏障系统中炎症因子起到促炎的作用[55-56],特别是对体外培养的上皮细胞的物理屏障,其作用机制尚不清楚,但这可能是因为体外培养的上皮细胞微生物屏障与化学屏障功能不完善导致的。研究已经证实,细胞因子如IFN-γ能够增加体外培养的上皮细胞的通透性,并通过NO调控实现[57]。黄芪多糖能够显著下调体外培养的Caco2细胞中TNF-α、IL-1β和IL-8的分泌水平[40],缓解LPS对细胞的损伤。细胞因子在体外培养的上皮细胞中的具体作用及影响机制还需进一步探索。
4.2 提高肠道粘膜免疫SIgA分泌水平
肠道内SIgA是肠道免疫非常重要的成分,由粘膜固有层的浆细胞分泌产生,并通过上皮细胞进入肠腔内,为粘膜表面提供多重保护作用。并且它可以选择性地转移到其他粘膜组织,从而建立一种广泛而稳定的黏液屏障系统,防止病原微生物入侵[58]。SIgA多以四聚体和二聚体形式存在,具有4或8个抗原结合位点,比单体SIgA具有更高的亲和性,因此在中和肠道内毒素,阻止病原侵入,抑制病原微生物在肠上皮细胞的黏附和定殖方面发挥重要的功能。且其分泌细胞数量也常被用作评价肠道粘膜免疫的指标,从中草药中提取的多糖多具有提高小肠中IgA+分泌细胞数量的作用[59],在H22肝癌耐受小鼠中,灵芝多糖的添加能够显著增加小肠中IgA+细胞数量[60]。此外据报道,SIgA能够增强肠道黏液的亲和力,调控IgG介导的反应以助于隔离细菌与粘膜的接触,并抑制感染部位的炎症反应,同时作为肠道分泌最多的免疫球蛋白,其分泌水平反映了粘膜免疫机制的成熟度,是肠道屏障功能的重要贡献者[61]。而植物提取物作为一种天然活性物质在一定程度上能够促进SIgA分泌,从淫羊藿提取的多糖可显著提高肉仔鸡十二指肠和空肠中SIgA的分泌,增强粘膜免疫[29]。SIgA的分泌诱导转化受到TGF-β的调控,白术多糖能够通过提高十二指肠中TGF-β基因表达水平而促进SIgA的分泌[46],提高粘膜免疫。
4.3 调节肠道粘膜微血管内皮细胞NO的分泌量
NO是一种生物信息传递载体,能保护机体非特异性免疫和维持机体微循环内环境的恒定,是体内非特异性防御反应系统的组成部分,在血管调节、神经信息的传递及免疫功能调节等方面发挥着重要的生物学功能[62]。在机体内,NO通过非特异性杀伤寄生虫、细菌、真菌及肿瘤细胞起到增强机体非特异性免疫的功能。胃肠道巨噬细胞的最主要功能之一是杀死并清除穿过上皮细胞的细菌,而NO能够调控巨噬细胞的功能,例如抑制多种细胞因子如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等的合成,保护胃肠主要细胞免于损伤,对粘膜防御具有重要的意义[63]。在肠道内,NO能够抑制中性粒细胞附着于肠系膜内皮,阻断血小板黏连,防止肥大细胞活化,保护胃肠粘膜免受各种刺激。但NO的调控具有双向性,在肠道早期损伤时,如发生中性粒细胞黏附、局部缺血或肥大细胞活化,NO起到保护肠道粘膜屏障的作用;在强炎症时,抑制NO的合成可改善屏障紊乱。Guo等[64]发现积雪草苷(Asiaticoside)具有抗炎特性,能够通过抑制NO的合成促进胃肠炎症的愈合,因为过高的NO可能直接损伤粘膜,破坏actin细胞骨架,抑制ATP形成,扩张紧密连接,显著增加肠道渗透性,损伤肠道粘膜[65]。NO合成酶 (inducible nitric oxide synthase,iNOS) 抑制剂能够阻止IFN-γ引起的肠道通透性的增加[49],红葡萄酒中的多酚可通过抑制iNOS的基因表达水平来减少结肠肿瘤发生的几率[66]。此外,肠道黏液层是保护上皮细胞免于物理损伤,减少细菌对上皮的黏附和粘膜侵袭的重要屏障,低量NO能够引发胃肠黏液的释放。有研究表明,橡树(Quercusdentata) 和石榴(Punicagranatum)中的多酚提取物能够降低体外培养的肠道Caco-2细胞中NO的合成量,缓解炎症损伤[67]。总体而言,维持较低剂量的NO对肠道粘膜屏障起到保护的作用。
4.4 对微生物菌群的影响
肠道微生物是肠道粘膜屏障的重要影响因素,它不仅构成了粘膜微生物屏障,同时对肠道通透性,TJ的装载、构建以及MUC2的合成、分泌有着不可忽视的作用[68]。植物提取物被畜禽摄入后,可以通过提高肠道上皮的免疫防御机制,抵抗病原微生物引起的腹泻。研究表明,植物提取物的疏水性能够使细菌细胞膜和线粒体膜上磷脂分开,破坏细胞结构,增大通透性,引起胞内离子等内容物外流,最终导致细菌死亡[69]。牛至中香芹酚可破坏绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的磷酸分子,导致细菌失活[70]。石榴提取物能够增加粪便双歧杆菌和乳酸菌数量,减少大鼠炎症标志物[25]。肠道菌群的改善不仅减少了腹泻,对粘膜免疫屏障也起着重要的影响。肠道内有益菌,如枯草芽孢杆菌的增多可以显著改善肠道形态,提高杯状细胞的数量,同时还能够提高occludin,claudin-2与claudin-3的基因表达水平[71],乳杆菌能够调控TJ蛋白组的特性,并对化学诱导的上皮屏障损伤起到保护作用[72]。绿茶提取物[73]和白藜芦醇[74]都可显著增加肠道内乳酸杆菌或双歧杆菌的数量,改善肠道健康。在肉仔鸡日粮中添加5%牛至精油能够显著增加回肠绒毛高度和乳酸菌数量,减少回肠和盲肠内容物中大肠杆菌数量[75]。
5 小结
植物提取物特别是植物多糖、多酚、精油作为天然功能性饲料添加剂,在机体细胞免疫和肠道免疫方面均发挥着重要作用。但目前对植物提取物在畜禽肠道健康的研究大多停留在改善肠道内环境、肠道结构与微生物菌群方面,在改善肠道屏障、粘膜免疫,特别是包括紧密连接和黏蛋白在内的对深层机理的研究尚且不足。探索植物提取物增强粘膜免疫的深层机理,对开发新型肠道健康促进剂,防治肠道疾病具有十分重要的意义。