H2S对NaCl胁迫下草木樨幼苗生理指标及 抗氧化酶活性的影响

董 靖，李红丽，董 智，白文华

(山东省土壤侵蚀与生态修复重点实验室，泰山森林生态站，山东 泰安 271018)

盐胁迫是影响植物生存、生长和生产力的主要环境因素之一[1-2]。盐碱土中的氯化物、硫酸盐及含盐量导致的盐胁迫不仅直接影响植物种子的萌发、植物的生长和产量[3]，而且影响植物的抗氧化系统，破坏细胞的结构和功能，影响光合作用等代谢活动，使植物的正常生命活动受到影响[4-6]，不同的植物可以通过内部调节或外源物质调节而减缓盐胁迫对植物体内生理生化、氧化损伤、膜透性、叶绿素等的伤害[7-10]。因此，深入了解植物对盐胁迫的各种信号响应机制以及抵御盐胁迫的各种途径具有十分重要的价值[11]。

H2S是生物体内继NO和CO后的第3种气体信号分子[12]，在生物生长发育及非生物应答胁迫等方面具有重要作用，已成为生物学研究的热点[13]。已有的研究表明，H2S可以促进种子萌发，根的发生，调节光合作用、气孔运动，并参与抵抗重金属、盐、干旱、高温等胁迫[14-17]。

草木樨(Melilotussuaveolens)为豆科草木樨属一、二年生草本植物，其根系发达，固土与改良土壤能力强，防风固沙效果好，营养丰富，适口性好，是优良的保持水土、防风固沙和改良土壤用牧草，也是山东省当家牧草之一。草木樨抗盐能力较强，也是改良土壤盐碱化的理想牧草[18]。尽管草木樨的耐盐能力较一般植物强，但盐胁迫依然会使其产量显著下降，研究草木樨的抗盐特性及机制可以提高其在盐碱地改良中的应用价值。尽管汪永平等[19]比较研究了不同品种草木樨的抗盐性，然而在外源物质对草木樨抗盐性的研究方面尚未见报道，外源物质对其生理生化作用的机制尚不清晰。为阐明外源H2S在草木樨抗盐性中的作用，本研究通过外源H2S处理NaCl胁迫下的草木樨幼苗，对草木樨幼苗生长过程中的生理生化指标及抗氧化酶活性变化进行研究，旨在探索外源H2S对盐胁迫下草木樨幼苗生长的缓解效应，并筛选出缓解NaCl盐胁迫的适宜H2S浓度，为提高草木樨耐盐性及揭示其耐盐机理提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2017年4-7月在山东农业大学林学试验站的全日光温室内(36°16′ N，117°11′ E)进行，试验期间日照时间平均为10 h，日均温在20～25 ℃，相对湿度65%，CO2浓度基本与大气浓度持平。

1.2 材料与处理

试验所用草种采自内蒙古草木樨栽培草地，发芽率95%以上。挑选种粒饱满、大小均匀的草木樨种子，用3%的H2O2消毒10 min，蒸馏水冲洗3～4次，浸种催芽后播种于装有蛭石的花盆中。花盆高35 cm、上口径35 cm，下口径30 cm，花盆底部开孔，并用无纺布遮盖，保证盆内基质不外流，且可通过底部开孔吸水。种子萌发后浇灌1/2 Hoagland完全营养液，生长40 d后选择长势良好的植株进行水培处理。取幼苗用海绵条包裹好，固定在泡沫板的孔内，每个孔固定幼苗4株，然后将固定有幼苗的泡沫板转移到装有完全营养液的塑料盆(高13 cm，宽28 cm，长35 cm)中进行培养(为了避免光照使营养液的温度升高和营养液表面生长绿藻，试验用铝箔纸将塑料盆紧密包裹)，每个塑料盆内装有4.4 L营养液。共分为8个处理(表1)，分别为：对照[CKn和CKp(150 mmol·L-1NaCl的确定是在预试验中完成的，该NaCl浓度处理幼苗15 d后多个指标均为空白对照的50%左右，且其他指标与对照差异极显著，故选用此浓度)]；Ⅰ，150 mmol·L-1NaCl+0.025 mmol·L-1NaHS；Ⅱ，150 mmol·L-1NaCl+0.05 mmol·L-1NaHS；Ⅲ，150 mmol·L-1NaCl+0.1 mmol·L-1NaHS；Ⅳ，150 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1NaHS；Ⅴ，150 mmol·L-1NaCl+0.4 mmol·L-1NaHS；Ⅵ，150 mmol·L-1NaCl+0.8 mmol·L-1NaHS。试验中先将NaHS按处理浓度配制成溶液后直接喷施在草木樨叶面，以叶片布满液滴为准，每天喷施1次，获得不同的H2S处理，NaCl直接配制在营养液中，每个处理3次重复。处理15 d后取样测定各个指标。为保证NaCl浓度稳定，每2 d换1次营养液，并且每天向营养液中通入空气，以保证氧气的供应充足。

表1 试验处理编号Table 1 Experimental design

1.3 测定指标及方法

叶片相对含水量采用蒸馏水浸泡及烘干称重法测定；细胞膜相对透性用电导法测定；采用水合茚三酮法测定游离脯氨酸含量；采用蒽酮法测定可溶性糖含量；采用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量[20]；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量；酶液的提取参考de Azevedo等[21]的方法，SOD活性采用邻苯三酚自氧化速率法测定，POD活性采用愈创木酚法测定，CAT活性采用紫外吸收法测定；叶绿素含量采用丙酮乙醇混合液提取，然后用分光光度计测定[20]。

所有数据均用3个重复的平均值±标准误表示，SPSS(16.0)软件进行单因素方差(ANOVA)统计分析，Duncan法多重比较，差异显著定义为P<0.05，利用隶属函数法[22]对各指标进行综合比较，Excel 2010制作相应图表。

2 结果与分析

2.1 外源H2S对盐胁迫下草木樨幼苗叶片相对含水量及相对电导率的影响

150 mmol·L-1盐胁迫下(CKp)草木樨幼苗叶片相对含水量显著降低，较CKn下降了20.99%(P<0.05)(表2)；而相对电导率显著升高，较CKn上升了139.97%(P<0.05)。不同浓度的NaHS缓解了盐胁迫对叶片相对含水量及相对电导率的影响，随NaHS浓度的增加，叶片相对含水量呈先升高后降低的趋势，而相对电导率则呈先降低后升高的变化，各NaHS浓度下叶片相对含水量与相对电导率差异显著(P<0.05)。NaHS处理中，叶片相对含水量在0.8 mmol·L-1时最低，0.1 mmol·L-1时最高；叶片相对电导率则正好相反，在0.1 mmol·L-1时最低，在0.8 mmol·L-1时最高。可以看出，0.1 mmol·L-1的NaHS显著缓解了盐胁迫对草木樨幼苗叶片相对含水量和相对电导率的影响(P<0.05)，相对含水量较CKp增加了26.85%，相对电导率减少了57.54%；与CKn相比较，相对含水量和相对电导率的差异均不显著(P>0.05)。

2.2 外源H2S对盐胁迫下草木樨幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

盐胁迫引起了游离脯氨酸含量的增加，150 mmol·L-1NaCl盐处理的草木樨幼苗游离脯氨酸含量为299.52 μg·g-1，是空白对照CKn的379.57%(表2)。在NaCl盐处理中喷施不同浓度的NaHS后，均显著地抑制了盐胁迫造成的游离脯氨酸含量的升高(P<0.05)。NaHS处理浓度从小到大的草木樨幼苗的游离脯氨酸含量分别为CKp的84.29%、55.77%、26.80%、26.52%、45.14%和70.99%。各处理以0.1和0.2 mmol·L-1的NaHS对盐胁迫造成游离脯氨酸含量升高的抑制效果最佳，其脯氨酸含量分别为未受胁迫的CKn的1.02倍和1.01倍，三者间差异不显著(P>0.05)。

空白对照CKn草木樨幼苗的可溶性糖含量为6.21 mg·g-1，150 mmol·L-1NaCl处理的为3.65 mg·g-1，盐胁迫使得草木樨幼苗体内可溶性糖含量显著下降(P<0.05)(表2)。喷施NaHS后可以增加草木樨幼苗体内可溶性糖的积累，不同浓度NaHS处理的效果不同，总体上随着浓度的增加呈先升高后降低的趋势。各浓度处理条件下，0.1 mmol·L-1时草木樨体内可溶性糖含量最高，为6.10 mg·g-1；而0.8 mmol·L-1时最低，为3.32 mg·g-1，是单纯盐胁迫的90.96%，且可溶性糖从0.4 mmol·L-1时即开始低于CKp。说明适宜浓度的NaHS可以缓解盐胁迫造成的可溶性糖含量的下降，但是施用NaHS的浓度过高，会使可溶性糖的含量降得更低。

盐胁迫降低了草木樨幼苗中的可溶性蛋白含量，150 mmol·L-1NaCl胁迫下可溶性蛋白含量是未受胁迫的对照CKn的52.79%(表2)；施加NaHS可以抑制盐胁迫造成的草木樨可溶性蛋白含量的降低，但浓度达到0.8 mmol·L-1时，可溶性蛋白含量降至最低，与单纯盐处理间差异不显著(P>0.05)，说明该浓度未能缓减盐胁迫对可溶性蛋白含量的作用。不同浓度NaHS处理的草木樨幼苗的可溶性蛋白含量在62.42～108.12 mg·g-1，总体上随浓度增大表现为先升高后降低的趋势；除0.8 mmol·L-1NaHS处理外，其余浓度均显著高于单纯NaCl盐处理(P<0.05)，各浓度处理下以0.1 mmol·L-1的NaHS处理对可溶性蛋白含量降低的抑制效果最好。

2.3 外源H2S对盐胁迫下草木樨幼苗叶片抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

与正常条件下的草木樨幼苗相比，盐胁迫使得草木樨幼苗中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均发生不同程度的降低，且降低程度显著(P<0.05)(图1)。喷施NaHS可以明显缓解抗氧化酶活性的降低(P<0.05)，NaHS浓度为0.025、0.05、0.1 mmol·L-1时，SOD、POD、CAT活性都逐渐升高，当浓度到达0.1 mmol·L-1(POD是在0.2 mmol·L-1)之后，抗氧化酶活性开始逐渐下降，但均高于CKp或与CKp接近。这说明150 mmol·L-1的NaCl使草木樨幼苗的SOD、POD、CAT活性下降，而喷施0.025～0.8 mmol·L-1的NaHS均能使抗氧化酶活性有所升高，提高其抗盐能力，不同浓度处理以0.1 mmol·L-1左右时的作用效果最好。

表2 H2S对盐胁迫下草木樨幼苗相对含水量、相对电导率及渗透调节物质含量的影响Table 2 Effect of sodium hydrogen sulfide on relative water content, relative electrical conductivity, and osmotic adjustment content in sweet clover seedling under salt stress

同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different treatments at the 0.05 level.

图1 H2S对盐胁迫下草木樨幼苗抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响Fig. 1 Effect of sodium hydrogen sulfide on antioxidant enzyme activity and MDA content in sweet clover seedling under salt stress

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，图2同。

Different lowercase letters indacate significant difference between different treatments at the 0.05 level; similarly for the figure 2.

未经NaCl胁迫的草木樨幼苗中丙二醛(MDA)含量为1.65 μg·g-1，经NaCl胁迫后其MDA含量则升高到2.83 μg·g-1，是前者的1.72倍。对NaCl胁迫下的草木樨幼苗喷施不同浓度NaHS，MDA含量呈先降低后升高的趋势；其中喷施0.1 mmol·L-1的NaHS，其MDA含量在经NaCl处理的草木樨幼苗中最低，说明0.1 mmol·L-1的NaHS能较好缓解150 mmol·L-1的NaCl造成的MDA含量的升高(图1)。

2.4 外源H2S对盐胁迫下草木樨幼苗叶片叶绿素含量的影响

未受盐胁迫的草木樨幼苗叶绿素a、b含量最高，其次为0.1 mmol·L-1NaHS处理，最低的则是0.8 mmol·L-1NaHS处理。单纯150 mmol·L-1的NaCl胁迫使草木樨幼苗的叶绿素a含量和叶绿素b含量显著降低(P<0.05)，分别为CKn的54.11%和54.22%(图2)。外源NaHS的添加有利于叶绿素a、b的合成，缓减盐胁迫引起的叶绿素a、b含量的降低。不同浓度NaHS处理下叶绿素a、b含量间差异明显，随浓度增加呈现先升高后降低的变化趋势，其中Ⅲ处理和Ⅳ处理中叶绿素a的含量分别是CKn的87.78%、68.30%，叶绿素b的含量分别是CKn的87.45%、68.05%。因此，0.1和0.2 mmol·L-1的NaHS处理可以显著缓解盐胁迫，增加草木樨幼苗的叶绿素a和叶绿素b含量。

图2 H2S对盐胁迫下草木樨幼苗叶绿素含量的影响Fig. 2 Effect of sodium hydrogen sulfide on chlorophyll content in sweet clover seedling under salt stress

2.5 隶属函数法对盐胁迫下草木樨幼苗的综合评价

利用隶属函数法，对8个处理草木樨幼苗的生理及抗氧化酶活性等12个指标进行综合评价。各指标中除相对电导率、游离脯氨酸和丙二醛与幼苗生长状况呈负相关关系外，其余指标与幼苗生长状况均为正相关关系，带入计算公式得出表3，表中数值越高幼苗生长状况越好。从表中可以看出CKn组幼苗生长状况最好，其次为Ⅲ组，最差的为CKp组，Ⅵ组接近于CKp。说明盐胁迫严重危害了草木樨幼苗的正常生长，而0.1 mmol·L-1NaHS处理极大地缓解了盐胁迫对幼苗各指标造成的影响，使得幼苗能够正常生长，但是浓度过高或过低时，缓解效果都会大大减弱。

表3 各指标的隶属函数值及综合排序Table 3 The membership function of each index value and comprehensive ranking

3 讨论与结论

细胞膜是活细胞和环境之间的界面和屏障，各种不良环境对细胞的影响往往首先作用于细胞膜[23]。相对电导率反映了植物细胞膜透性的大小，植物受到的损伤越严重叶片相对电导率值越大，反之则越小[24]。本研究中，草木樨幼苗在150 mmol·L-1的NaCl处理下相对含水量下降、相对电导率升高，说明此时草木樨受到了盐胁迫，细胞失水，细胞膜结构和功能受损，膜透性增大；而不同浓度的NaHS处理使得叶片相对水量增大，相对电导率下降，因而，可以认为信号分子H2S可以在一定程度上帮助草木樨对抗盐胁迫，并通过维持较高相对含水量和减小细胞膜透性的方式缓解盐胁迫造成的伤害。

渗透调节是植物在逆境条件下，通过代谢活动增加细胞内溶质浓度，降低其渗透势而保持继续吸水，维持较正常的代谢活动[25]。植物体内的渗透调节物质很多，本研究主要研究了游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量变化。游离脯氨酸含量的积累是植物渗透调节的重要部分，当植物遭受非生物胁迫时，会产生比平时更多的脯氨酸用以维持细胞渗透平衡[26]和抵抗逆境胁迫[27]。从研究结果来看，NaCl胁迫使草木樨幼苗中游离脯氨酸含量显著增加，NaHS处理则能降低其含量的增加,说明H2S缓解了盐胁迫造成的伤害，草木樨用来抵抗盐胁迫而产生的脯氨酸含量减少(表2)。可溶性糖是植物体内主要的储能物质，是植物生长发育的基础，对逆境条件下的植物细胞起渗透调节作用[27]。研究表明，在胁迫环境下，植物所含的可溶性糖含量会大幅降低，可溶性糖含量越低植物所受胁迫越严重[28]。本研究中150 mmol·L-1的NaCl胁迫使草木樨幼苗中可溶性糖含量显著降低，这与前人研究[27-28]结果相同，盐胁迫的同时外施NaHS又可提高其含量，说明植物受胁迫程度可以通过施用NaHS得到缓解。可溶性蛋白含量也是渗透调节的重要指标之一[29]，当盐浓度达到一定值时，植物体内的可溶性蛋白含量降低[30]。本研究中，单纯盐处理的草木樨幼苗中可溶性蛋白含量最低，0.1 mmol·L-1NaHS处理中含量则接近于未受盐胁迫的含量，这可能是由于H2S解除了盐胁迫对某些蛋白质合成途径的抑制，同时降低了蛋白质的水解，使可溶性蛋白含量保持较高水平。

抗氧化酶活性及丙二醛含量的变化显示了植物抗氧化损伤程度，是研究植物非生物胁迫的重要指标[31]。盐胁迫条件下，植物细胞线粒体和叶绿体电子传递中的泄露电子积累，刺激活性氧大量产生，过量的活性氧使蛋白质、脂质等生物分子氧化降解，导致酶失活，使细胞内产生氧化损伤和膜结构损伤[32]。膜脂过氧化产生的丙二醛则可通过与蛋白质、核酸反应或影响纤维素分子间的桥键而抑制蛋白质的合成[33]。研究中，NaHS在溶液中分解为Na+和HS-，HS-结合H+形成H2S，H2S透过细胞膜扩散，迅速到达线粒体和叶绿体基质作用于草木樨的抗氧化酶体系，提高抗氧化酶活性。这恰是H2S作用并提高抗氧化酶活性的本质[34-36]。在抗氧化酶体系中，SOD以O2-为基质进行歧化反应，将毒性较强的O2-转化为毒性较轻的H2O2，然后CAT将H2O2歧化为H2O和O2，同时POD利用各种基质作为电子供体将H2O2还原为H2O[37]。正是通过这一系列的过程，草木樨幼苗中的过量活性氧被清除，细胞膜结构和功能的损伤降低，膜脂过氧化的产物丙二醛含量降低。从试验结果来看，NaHS对抗氧化酶活性的提高是有剂量效应的，随浓度的增大先升高后降低，当喷施浓度过高时反而抑制了草木樨抗氧化酶活性，MDA含量又有所增加(图1)，使得细胞内产生氧化损伤和膜结构损伤，这一点可为试验中0.8 mmol·L-1的NaHS处理下相对电导率增大，且与盐胁迫处理相近所证实(表2)。

因此可以得出结论，1)NaHS处理可提高NaCl胁迫下草木樨幼苗叶片相对含水量，降低叶片相对电导率，以此缓解对草木樨细胞膜的危害；NaHS处理可降低因盐胁迫而造成的游离脯氨酸的积累，促进可溶性糖含量与可溶性蛋白含量的增加，增强抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，增加叶片中的叶绿素含量；2)不同浓度NaHS处理对缓解草木樨的NaCl盐胁迫效果差异显著，随浓度的增加，各指标的变化并不相同，但各指标均显示出一定的剂量效应。采用隶属函数法对不同处理的综合效应的评价表明，对于NaCl盐胁迫(150 mmol·L-1)的草木樨幼苗，6种NaHS缓解盐胁迫浓度处理，以0.1 mmol·L-1的缓解效果最好，其次为0.2 mmol·L-1，而0.8 mmol·L-1缓解效果最差。