燕麦萌发耐盐性及指标筛选

陶 金，侯龙鱼，杨 杰,3，宋世环,4，白文明,4， 潘庆民,4，殷淑艳，郝建玺，张文浩,3,4

(1.中国科学院植物研究所, 植被与环境变化国家重点实验室,北京 100093; 2.呼伦贝尔生态产业技术研究院，内蒙古 呼伦贝尔 021008； 3.中国科学院大学生命科学学院,北京 100049; 4.中国科学院内蒙古草业研究中心,北京 100093)

土壤盐渍化是种植业生产中仅次于干旱的第二大非生物胁迫因子[1]。据统计盐渍化面积约占地球陆地总面积的6.7%，占我国国土面积的1/3[2]。种子萌发期是作物能否在盐胁迫下完成生育周期最为关键的时期，对盐胁迫的积极响应决定着立苗和后期的生长发育[3]。因此，研究盐胁迫下作物种子的萌发特性具有重要的意义。

燕麦是一种粮、经、饲、药等多用途植物，生产上主要种植皮燕麦(Avenasativa)和裸燕麦(A.nuda)[1]。传统上我国主要种植裸燕麦，种植区域集中在西北、华北和西南的高寒地区[1]。近年来，随着我国农业产业结构调整，振兴奶业行动，草牧业理论的提出及实施，饲草型燕麦品种受到普遍重视，皮燕麦在国内种植面积增加迅速[4]。燕麦作为优质饲草,我国进口量由2008年的0.15 万t增加到2017年的30.81万t (http://www.xumurc.com/main/ShowNews_57673.html)。传统上适宜我国燕麦种植的地区多为盐碱地集中区[1]，因此，研究燕麦品种间耐盐差异以及盐胁迫下燕麦萌发幼苗生长特征，对田间生产选择适宜燕麦品种具有重要的意义。

燕麦品种间耐盐性在裸燕麦品种间[1,5-6]、皮燕麦品种间[7-10]、皮裸燕麦综合比较[11-12]时均有差异。随着盐浓度的升高，各品种的发芽指标，如发芽率、发芽指数、根长额芽长均呈现规律性变化[12-13]。此外，也有燕麦品种间的耐盐生理机制[12-13]、蛋白组学等[14]的研究报道。抗氧化酶系统超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等均随着盐胁迫浓度的增加有规律性的改变[12-13]。但是在判定可以准确指示盐胁迫条件下的萌发特征时存在争议[1,11-12],如发芽率和发芽指数的差异[1,11]，以及根长和芽长的耐盐敏感性[8,11,13]。因此，选择合适的指示指标，准确评价盐胁迫下燕麦的萌发特征，可以更准确地比较燕麦品种间的耐盐性。

随着皮燕麦品种的引进和推广，国外品种在我国的种植面积逐年递增。因此，选择有代表性的引进皮燕麦品种，以及国内皮燕麦和裸燕麦主要推广品种，比较品种间的耐盐性，同时利用主成分分析法，筛选耐盐性指示指标，为燕麦耐盐性的比较提供基础，同时也为燕麦田间生产选择品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验选用10份燕麦品种，其中皮燕麦8份、裸燕麦2份。青海444和青引2号为国内主要推广的燕麦饲草品种，花早2号和坝莜1号为国内主要推广的裸燕麦品种，其他为进口的皮燕麦饲草品种。品种、来源及收获时间如表1所列。

1.2 试验设计

用分析纯NaCl试剂分别配制0、50、100、200 mmol·L-1的盐溶液作培养液。采用纸上发芽法，在培养皿(直径d=150 mm)内铺入3层滤纸，用移液枪吸取14 mL(预试验证明14 mL为浸透3层滤纸的溶液量)不同浓度的盐溶液于培养皿内，以等量蒸馏水作对照。选取种粒饱满、大小一致的燕麦种子，每组100粒，各浓度重复3次。置于赛福智能人工气候箱中培养，培养条件25 ℃恒温，每天16 h光照，光照强度150 μmol·(m2·s)-1，相对湿度80%。每天用蒸馏水补充到初始滤纸的浸透水平。胚根为种子长径1/2时判定为萌发。试验中萌发只统计正常苗，判定标准参考国际牧草种子检验规程(ISTA)[15]。每天记录发芽种子数，培养7 d后，结束发芽试验。每皿选取10株苗测定芽长和根长。发芽率(GP)，发芽指数(GI)，平均萌发时间(MGT)、萌发整齐性指数(Z)的计算均参考文献[16-17]，按照以下公式计算：

GP=∑ni/T×100%；

GI=∑ni/ti；

Z=∑Cni,2/N；

Cni,2=ni(ni-1)/2；

N=∑ni(∑ni-1)/2。

式中：ni为第i天种子萌发的粒数，T为供试种子总数，ti为试验开始到第i天的天数，k为种子萌发的总天数。

表1 试验燕麦品种和来源Table 1 Oat varieties and sources

为了消除燕麦种子初始指标间的差异性，选择相对萌发指数来评价各指标间的关系及盐胁迫下的抑制程度。对照条件下各指标为1时，盐胁迫下各指标的比例即为相对指标[17]。

1.3 数据统计与分析

首先比较盐胁迫对6个发芽指标的影响，对比分析盐胁迫浓度下，各个指标的相应变化。运用相关分析，比较6个萌发指标之间的相关性。运用主成分分析筛选6个指标降维并找出代表性的主成分即指示指标。然后根据6个指标对燕麦进行聚类分析，得出供试品种盐胁迫下萌发的相似性。

以单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小差异显著法(LSD)在0.05水平上检验各处理间的差异显著性。方差分析与多重比较均用SPSS 22.0软件辅助完成。图由SigmaPlot 10.0辅助完成。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对燕麦品种发芽指标影响

盐胁迫条件下各品种萌发耐盐性表现出差异性(图1)。品种领袖、爱沃、牧王、燕王和青海444发芽率在0、50、100和200 mmol·L-1盐溶液间均没有显著差异(P>0.05)。NaCl浓度为200 mmol·L-1时，品种青引2号发芽率显著降低(P<0.05)。NaCl浓度为100 mmol·L-1时，品种贝勒、花早2号和坝莜1号发芽率受到显著抑制作用(P<0.05)。NaCl浓度为50 mmol·L-1时，品种太阳神发芽率受到显著抑制作用(P<0.05)(图1)。

萌发整齐性指数反映种子萌发的整齐程度。整齐性指数介于0-1，整齐指数越大，则萌发越整齐[16-17]。各品种在不同盐浓度下整齐性指数变化各异(图1)。随着盐浓度的升高，品种领袖、花早2号和坝莜1号均显著下降(P<0.05)。品种青海444各浓度间差异不显著(P>0.05)。其他品种没有一致的规律性。两个裸燕麦坝莜1号和花早2号均表现出随盐浓度增加而下降的规律，皮燕麦的规律性较差，这与燕麦萌发时间较短有关，大部分的燕麦在2～4 d内就完成萌发。

平均萌发时间指示种子萌发的速率，萌发时间越短，则萌发越快[17]。随着盐浓度的提高，各燕麦品种的平均萌发时间均增加(图1)。与对照相比，NaCl浓度为200 mmol·L-1时，品种领袖、太阳神和花早2号平均萌发时间显著增加(P<0.05)；NaCl浓度为50 mmol·L-1时，品种爱沃、贝勒、燕王和青引2号的平均萌发时间显著增加(P<0.05)。

不同小写字母表示同一品种不同盐梯度间差异显著(P<0.05)。

Different lowercase letters indicate significant difference for each variety among different NaCl concentrations at the 0.05 level.

发芽指数同样反映种子萌发的活力和萌发速率。发芽指数越高，则萌发越快[17]。除爱沃外，随着盐浓度的增加，各品种萌发指数均下降(P<0.05)。NaCl浓度在50 mmol·L-1时，爱沃、牧王和青海444未表现出显著差异，其他品种发芽指数即出现显著下降趋势(P<0.05)。

芽长和根长可指示种子萌发时幼苗生长的速率[17]。除青海444和花旱2号 ，随着盐浓度的增加，燕麦品种呈现出逐步下降趋势，说明盐浓度增加，抑制了芽和根的生长(图1)。青海444、花早2号在200 mmol·L-1NaCl浓度时的芽长、100 mmol·L-1NaCl浓度时的根长显著下降(P<0.05)，其他品种在50 mmol·L-1NaCl浓度时的芽长和根长即显著降低(P<0.05)，说明大部分燕麦品种芽长和根长对NaCl胁迫敏感。

综合分析，皮燕麦发芽率、发芽指数、平均萌发时间、芽长和根长均表现出较好的耐盐性，以青海444耐盐性最好。裸燕麦盐胁迫下各萌发指标相对较差，以坝莜1号最差。

2.2 盐胁迫下燕麦萌发各指标的相关性

种子萌发各指标间既有差别，又相互联系。盐胁迫对各指标的影响有着不同程度的差异(图1)。相关分析结果表明，除相对发芽率和相对萌发整齐性指数相关系数(r=0.036)不显著，其他两两指标均达到显著和极显著水平(表2)。相对发芽率和相对发芽指数(r=0.724**，P<0.01)、相对发芽指数和相对平均萌发时间(r=-0.837**，P<0.01)及相对芽长和相对根长(r=0.716**，P<0.01)相关系数较大，说明两两之间关系密切。相对平均萌发时间与其他5个指标间均为负显著相关。

2.3 盐胁迫下燕麦各萌发指标主成分分析

由于盐胁迫下燕麦种子萌发各指标间有密切的相关性(表2)。因此，采用主成分分析法，通过降维的方法筛选盐胁迫下燕麦萌发的指示指标。主成分分析结果表明，前两个主成分占到总信息量的78.24%，可用作燕麦萌发的指示指标(表3)。

表2 盐胁迫下各发芽指标相关系数Table 2 Correlation coefficients of germination indices under salt stress

*和**分别表示在0.05和0.01水平上显著相关。

*and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level, respectively.

表3 盐胁迫下发芽指标主成分结果与分析Table 3 Principal component analysis of germination indices under salt stress

主成分1主要包含相对发芽指数、相对平均萌发时间、相对芽长和相对根长，故定义为速率综合指标。主成分2主要包括相对发芽率和相对萌发整齐性指数，定义为比率综合指标(表3)。从主成分矢量图可以看出，平均萌发时间和发芽指数在主成分1中有显著的负相关性，相对发芽率和相对萌发整齐性指数在两个主成分中均有一定量的贡献(表3，图2)。

图2 盐胁迫下燕麦各萌发指标主成分分析Fig. 2 Correlation analysis of different germination indexes of oats under salt stress

根据两个主成分系统矩阵，可获得各品种的主成分因子得分公式[18]，如下：

F1=0.597X1+0.485X2+0.930X3-0.892X4+0.819X5+0.821X6；

(1)

F2=0.636X1-0.743X2+0.225X3+0.228X4-0.033X5+0.067X6。

(2)

根据F1和F2的值，各品种的综合得分：

F=0.599 65F1+0.182 73F2。

根据综合得分，对10个燕麦品种进行耐盐性排序(表4)，发现皮燕麦贝勒、青海444和领袖耐盐性较高，裸燕麦花早2号和坝莜1号耐盐性较低。整体来看，皮燕麦的耐盐性普遍高于裸燕麦。

表4 10个燕麦品种的耐盐性排序Table 4 Order of salt tolerance for oat cultivars

2.4 高盐胁迫下燕麦品种的聚类分析

综合200 mmol·L-1NaCl处理下6个萌发指标特征，利用系统聚类法得到10个品种的聚类树(图3)。结果和主成分分析结果基本一致，盐胁迫下皮燕麦的各指标的变化距离较近。两个裸燕麦品种花早2号和坝莜1号差异较大(图3)。

图3 200 mmol·L-1 NaCl胁迫下燕麦品种的聚类分析Fig. 3 Cluster analysis of 10 varieties based on germination indices under 200 mmol·L-1 NaCl stress

3 讨论与结论

3.1 燕麦品种与耐盐性

在200 mmol·L-1NaCl溶液培养条件下，燕麦种子多数发芽指标显著下降，可以作为评价燕麦品种间耐盐性的浓度标准。孙仁国[13]用200 mmol·L-1NaCl溶液处理4个燕麦品种种子，发现4个燕麦品种发芽指标均出现显著下降。对4个皮燕麦的耐盐试验也证明200 mmol·L-1显著改变了品种的所有萌发指标[8]。本研究中，尽管NaCl浓度为200 mmol·L-1时，皮燕麦发芽率没有显著下降，但发芽指数、平均萌发时间、根长和芽长等均有显著的变化。因此，200 mmol·L-1NaCl溶液(质量分数约为1.2%)为燕麦品种种子萌发耐盐性筛选浓度的最低标准。为了更好地比较指标间的变化，使发芽率指标在统计上也达到显著性变化，可以适当提高燕麦品种萌发耐盐筛选浓度，如250 mmol·L-1NaCl。

本研究发现，皮燕麦的耐盐性普遍强于裸燕麦。200 mmol·L-1NaCl对皮燕麦发芽率影响较小，主要降低了发芽指数、芽长、根长等活力指标。裸燕麦发芽率和发芽活力指标在50～100 mmol·L-1NaCl时出现显著下降，该结果验证了吕亚慈等[6]的结论，即坝莜1号发芽率在0.5%NaCl胁迫下发芽率和苗高显著下降。同时，吕亚慈等[6]研究发现，坝莜1号和花早2号耐盐性在其研究的6个裸燕麦品种中耐盐性最高。因此，在盐害程度较高的地区种植燕麦时，首选高耐盐的皮燕麦，选择裸燕麦时，为了保证出苗率和保存率，尽可能选择相对高耐盐的裸燕麦品种。

3.2 燕麦萌发耐盐指标的确定

研究结果表明，燕麦耐盐指标可以分为两类。一个是活力综合指标，一个是发芽和整齐度指标。陈新等[1]对278份燕麦品种的耐盐分析结果表明，发芽率比发芽势更稳定，武俊英等[11]研究证明也发芽率是野燕麦萌发期耐盐性的主要鉴定指标。本研究中，主成分分析结果表明燕麦发芽率和整齐度属于共同的主成分。其他指标发芽指数、平均萌发时间、芽长和根长为活力指标，属于共同的主成分，作为活力综合指标。NaCl对燕麦幼苗生长的影响主要是抑制其根、芽的生长，本研究结果中，许多品种在50 mmol·L-1NaCl浓度时根长和芽长即出现显著下降，而发芽率还维持在较高的水平。因此，速率综合指标比比率综合指标具有更强的敏感性，建议在盐胁迫下燕麦的耐盐评价时，首选速率综合指标，其次是比率综合指标。

有研究指出，低盐浓度(质量分数0.3%约为50 mmol·L-1)可以促进一些燕麦品种发芽率、芽长的生长[10-11]，也有研究指出低盐浓度对燕麦种子萌发没有促进作用[10-11]。本研究中花早2号和青海444芽长在50 mmol·L-1NaCl时显著高于对照，发芽率没有显著差异(图1)。一方面品种间的遗传特征和发芽率机制决定了低盐对生长的促进作用，即一定的离子浓度渗入可以激活代谢过程中的某些酶，有利于发芽产物和合成，促进幼苗生长[11]。另一方面，当供试种批质量较低时(如发芽率低于90%)，培养溶液中钠离子降低了种子内外水势差，缓解低活力的燕麦种子快速吸水伤害，使种子可以进行萌发前的自我修复，促进萌发和生长[9]，如PEG引发可以促进低活力种子的萌发和生长[19]。

萌发整齐性指数在描述和评价植物种子萌发特征中具有重要的作用[15]。随着盐浓度的升高，燕麦种子萌发整齐性指数规律性较差，且与发芽率没有显著相关性，这与其他物种的研究结果不一致[16]，主要是因为燕麦等萌发较快的物种，2～4 d内即可完成大部分的萌发，按天统计频率相对较低。而且在试验过程中因工作量较大，统计时间会出现一定的偏差，混淆了小时尺度上燕麦萌发速率的差异性。因此，用萌发整齐性指数评价燕麦等快速萌发的物种时，萌发种子数的动态统计需以小时为尺度，比如4～12 h。

皮燕麦的耐盐性普遍强于裸燕麦，盐胁迫下各萌发指标间的变化趋势相似度高于裸燕麦。皮燕麦以青海444和贝勒耐盐性最高，裸燕麦花早2号强于坝莜1号。盐胁迫下萌发速率综合指标较比率综合指标更敏感，在评价盐胁迫下品种间的耐盐性时，首选速率综合指标。