4种铁线莲属植物种子萌发特性

杨 艺，王 娜，马颖杰，王奎玲，刘庆华，刘庆超

(1.青岛农业大学园林与林学院，山东 青岛 266109； 2.威海水木原景观设计有限公司，山东 威海 264205)

毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis)植物多为木质或草质藤本，少数为多年生草本、亚灌木或灌木[1]。该属植物在我国各地均有分布，常见于低山区的丘陵处灌木丛中[2-5]，其花量大，花期长，观赏价值较高，养护管理方便，具有广泛的园林应用前景。该属植物主要以种子进行繁殖，但多需经过春化作用才能萌发，且该属植物种子发芽率普遍较低，发芽时间较长，某些杂交种的种子甚至需要3年时间才能萌发[6]，不利于引种、杂交等研究的进行，限制了该属植物在园林中的应用，其野生种质资源利用率较低。目前，国内外关于铁线莲属植物的研究主要集中于系统分类及药用价值研究，而对该属植物种子萌发特性的研究较少。

植物生长调节剂对种子的萌发具有一定调控作用，赤霉素(GA3)可打破种子休眠，细胞分裂素(6-BA)能促进细胞分裂和植物生长，二者常用于调节种子萌发。除此之外，温水浸种也是促进种子萌发、提高种子发芽率的方法之一。本研究以转子莲(C.patens)、棉团铁线莲(C.hexapetala)、大叶铁线莲(C.heracleifolia)和齿叶铁线莲(C.serratifolia)4种野生铁线莲属植物种子为试验材料，研究不同浓度GA3和6-BA及浸种温度对其萌发的影响，以期获得提高4种铁线莲属植物种子发芽率的方法，从而为野生铁线莲属植物的资源保存、杂交育种、引种栽培等提供一定理论依据，扩大该属植物在园林中的应用。

1 材料与方法

转子莲和大叶铁线莲采于辽宁省丹东市草莓沟，棉团铁线莲与齿叶铁线莲采于吉林省磐石市烟筒山。4种野生铁线莲属植物均于2014年引种于青岛农业大学园林与林学院试验地(120°12′ E， 36°20′ E，暖温带季风大陆性气候，年平均气温12.6 ℃，年平均降水量约700 mm)。2016年采集成熟种子备用。

1.1 铁线莲属植物种子基本参数测定

1.1.1种子形态观察 参考《中国植物志》及《中国植物种子形态学研究方法和术语》中的描述方法对种子形态进行观察描述。

随机选取50粒成熟种子，在体视显微镜下观察其形状及表面特性，利用游标卡尺测定种子(去宿存花柱)长、宽及厚度，利用英国皇家园艺协会比色卡测定成熟种子的颜色。

1.1.2种子千粒重测定 种子经肉眼检测，去除破粒、虫蚀粒和其他杂质，除去顶端宿存花柱后称千粒重。采取百粒法测定，重复8次，计算平均值，结果扩大10倍后获得种子千粒重。

1.1.3种子含水量测定 随机选取100粒种子放入称量瓶中，置于105 ℃恒温箱中2 h后放入干燥器中冷却30 min，称取重量，计算其含水量，重复3次。

1.2 铁线莲属植物种子萌发试验

选取饱满健康的种子，去除果皮后，使用2%次氯酸钠浸泡15 min，蒸馏水冲洗3次。

1.2.1浸种温度对4种铁线莲属植物种子萌发的影响 本研究分别对4种铁线莲种子设置了6个浸种温度梯度，以15 ℃室温条件为对照。将种子分别置于15、20、25、30、35和40 ℃的恒温水中浸种处理24 h后，取出种子置于直径11 cm培养皿中。以双层滤纸作为发芽床，大叶铁线莲放置于20 ℃光照培养箱中培养，棉团铁线莲于25 ℃/20 ℃的光照培养箱中培养，其余两种置于25 ℃的光照培养箱中培养[7-8]。发芽过程中用蒸馏水保湿。每个处理50粒种子，重复3次。

1.2.2激素种类及浓度对4种铁线莲属植物种子萌发的影响 对4种铁线莲种子设置了7个不同浓度梯度的6-BA和GA3处理(表1)。将种子放置于不同激素处理液中，清水作为对照，20 ℃下浸种24 h后置于培养皿中，放置于光照培养箱中进行全光照培养，各种子培养条件同1.2.1。每处理50粒种子，重复3次。

1.3 数据统计与分析

按照下列公式计算种子含水量、发芽率、发芽势[9-11]：

种子含水量=(初始重量-烘干重量)/初始重量×100%；

发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%；

发芽势=规定时间内发芽的种子数/供试种子数×100%。

表1 4种铁线莲种子激素处理浓度Table 1 The concentration of hormone treatments of four species of Clematis

以胚根长度为种子长度的1/2作为种子发芽的标志，以第1粒种子开始发芽作为种子开始发芽时间，连续7 d无种子发芽作为发芽结束标志。采用发芽后第7天的发芽情况计算发芽势。每天定时观察并记录种子发芽状况。

利用SPSS 22进行数据统计分析及单因素方差分析，并采用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 4种铁线莲属植物种子形态及基本参数

4种铁线莲种子均为瘦果，花柱宿存，果皮与宿存花柱表面均被白色绒毛(图1)，以棉团铁线莲种子表面被白色长柔毛最多。4种铁线莲种子的千粒重及含水量均差异显著(P<0.05)(表2)，不同铁线莲种子的长、宽及厚度也有差异。除棉团铁线莲种子较扁平外，其余3种铁线莲种子两面均凸起，有明显背脊(图1)。

图1 4种铁线莲属植物种子形态Fig. 1 The morphology of four species of Clematis seeds

指标Parameter转子莲 C. patens棉团铁线莲 C. hexapetala大叶铁线莲 C. heracleifolia齿叶铁线莲 C. serratifolia种子形态Seed morphology瘦果阔卵形Achene broadly ovate瘦果倒卵形、卵形,扁平Achenes flat,obovoid or ovoid瘦果卵形Achene, ovoid瘦果卵形Achene, ovoid成熟果色 Seed colour灰-橙色系166AGreyed-orange group 166A灰-橙色系175BGreyed-orange group 175B褐色系200BBrown group 200B灰-橙色系165CGreyed-orange group 165C长Length/mm5.17±0.37b6.16±0.39a3.73±0.15c3.34±0.32c宽Width/mm4.51±0.24a3.87±0.28b2.48±0.19c1.44±0.10d长∶宽Length∶width1.27±0.11c1.60±0.14b1.51±0.17b2.34±0.34a厚Thickness/mm1.81±0.02a1.21±0.01b0.98±0.01b0.63±0.01c千粒重Kilograin weight/g20.77±0.31a7.12±0.18b4.23±0.07c0.93±0.07d含水量 Water content/%18.47±0.36a12.46±0.32b8.80±0.11c6.90±0.15d

同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。果实颜色以英国皇家园艺协会比色卡中的组名、表名和大写字母表示。

Different lowercase letters within the same row indicate significant difference at the 0.05 level. Seed color is specified by a group name,a sheet name and a capital letter e.g. in RHS color chart.

2.2 浸种温度对4种铁线莲属植物种子萌发的影响

4种铁线莲种子在不同浸种温度作用下，各发芽指标均表现出较大差异。随着浸种温度的升高，转子莲种子发芽率呈现先降后增的趋势，但与对照相比，浸种温度的变化对该种子的发芽势无显著影响(P>0.05)(表3)。各处理下，35～40 ℃温水更有利于转子莲种子萌发，以35 ℃处理下种子发芽情况最好。

对于棉团铁线莲而言，其适宜萌发的温度范围较广，各温度处理均能显著促进铁线莲种子的萌发(P<0.05)(表3)。随着浸种温度的上升，棉团铁线莲种子发芽率呈现先增后降的趋势。除25 ℃外，各温度处理下种子的发芽势与对照相比无显著差异(P>0.05)。以25 ℃处理下种子发芽率最高，在90%以上。

大叶铁线莲种子在25 ℃处理下发芽率和发芽势最高，随后随着浸种温度的升高，种子发芽率、发芽势均显著下降(表3)。水温过高不利于大叶铁线莲种子的萌发，以25 ℃为最适浸种温度。该处理下，大叶铁线莲种子发芽率与对照相比显著增加(P<0.05)，发芽势无显著差异(P>0.05)。

对于齿叶铁线莲，种子发芽率、发芽势均随着浸种温度的升高均先增后减(表3)。与转子莲不同，25～30 ℃更有利于促进该种子萌发，以25 ℃为最适浸种温度。该处理下种子发芽率、发芽势均较其他温度处理显著增加(P<0.05)。

表3 不同浸种温度对4种铁线莲属植物种子萌发的影响Table 3 Influence of soaking seeds under different water temperatures on the germination characteristics of four species of Clematis

同列不同小写字母表示不同温度间差异显著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different temperatures at the 0.05 level; similarly for the following tables.

2.3 不同激素处理对铁线莲属植物种子萌发的影响

不同植物对激素的敏感度不同。随着6-BA及GA3浓度的增加，转子莲种子发芽率、发芽势基本呈现先增后减趋势(表4)。当6-BA浓度达40 mg·L-1及以上或GA3浓度达 800 mg·L-1时，转子莲种子发芽率均下降至0。各处理中，以400 mg·L-1GA3较好，该处理下种子的发芽率和发芽势显著高于除10 mg·L-1GA3外的其余处理(P<0.05)。

对于棉团铁线莲，不同浓度6-BA及GA3处理下种子萌发情况存在较大差异(表4)。各浓度6-BA处理下，种子发芽率及发芽势基本呈现下降趋势。当GA3浓度逐渐增加时，种子发芽率无规律变化，但变化显著(P<0.05)，发芽势则无显著变化(P>0.05)。各处理中，低浓度的6-BA和GA3均能显著提高棉团铁线莲种子的发芽率(P<0.05)，5 mg·L-16-BA和500 mg·L-1GA3处理为最适激素浓度，两种处理均显著提高种子发芽率(P<0.05)，但对发芽势无显著影响(P>0.05)。

当6-BA浓度逐步提高，大叶铁线莲种子发芽率、发芽势均逐渐下降。6-BA对大叶铁线莲种子萌发存在明显抑制现象。而伴随GA3浓度的增加，大叶铁线莲种子发芽率总体上呈现上升趋势(表4)。对于大叶铁线莲而言，低浓度6-BA及高浓度GA3均有利于种子萌发，以10 mg·L-16-BA处理下种子发芽情况最好。

与之相似，随着6-BA浓度的增加，齿叶铁线莲种子发芽率也显著下降(P<0.05)。而随着GA3浓度的上升，种子发芽率、发芽势总体呈现先降后增的趋势(表4)。6-BA及GA3均对齿叶铁线莲种子存在一定抑制作用，各处理中以5 mg·L-1GA3处理下种子发芽情况较好。

表4 不同激素处理对4种铁线莲属植物种子萌发的影响Table 4 Influence of two kinds of hormone treatment on the germination characteristics of four species of Clematis

3 讨论与结论

本研究结果表明，转子莲最适浸种温度为35 ℃，棉团铁线莲、大叶铁线莲及齿叶铁线莲种子萌发的最适浸种温度均为25 ℃，而黎彩霞等[12]发现毛蕊铁线莲最适浸种温度为20 ℃，说明不同植物的种子最适浸种温度存在差异，可能与种胚对高温的耐受能力有关。温水浸种可以起到与激素相似的促进作用，有效提高4种铁线莲属植物种子的发芽率，这与红芪(Hedysarumpolybotrys)[13]、萝芙木(Rauvolfiaverticillata)[14]、云南石梓(Gmelinaarborea)[15]及白皮松(Pinusbungeana)[16]等种子的研究结果相一致。

影响种子萌发的因素较多，其中大多由于种子的自身原因导致休眠。根据发生部位和诱因，种子休眠的类型可分为三大类，分别是内源性休眠、外源性休眠和综合性休眠[17]。内源性休眠指由胚导致的休眠，如胚发育不全，种子内抑制物质的存在，内源激素间的相互作用，或缺少必要的激素刺激其萌发；外源性休眠指胚以外的包被组织引致的休眠，如种子结构特征导致种子受到机械阻碍，从而限制了种子的萌发；综合性休眠则为内源和外源结合引致的休眠。目前对于铁线莲属植物种子休眠相关研究较少，仅许世泉等[18]对不同层积天数处理的东北铁线莲(C.ternifloravar.mandshurica)种胚进行切片观察发现该植物种子属于胚后熟类型，即内源性休眠，必须经过一定的后熟处理才能打破休眠。植物外源激素一方面可以解除种子休眠，如GA3可刺激胚芽的营养生长，诱导相关酶的合成，促进种子内部贮藏物质的降解[19-20]，另一方面可以调节种子内部激素平衡，如GA3能使内源吲哚-3-乙酸(IAA)含量增加，从而促进种子萌发[21]，因此植物外源激素在调节种子萌发过程中具有重要意义。许世泉等[22]通过比较东北铁线莲种子发芽过程中内源激素含量变化，发现处理初期种子内脱落酸(ABA)含量明显下降，生理成熟期后GA与玉米素核苷(ZR)含量持续升高，抑制萌发物质含量的减少与促进萌发物质含量的上升是解除东北铁线莲种胚的主要原因。邹竣竹等[23]发现适宜激素浓度浸种后，野牛草(Buchloedactyloides)内源生长素、GA及ABA含量上升，可溶性糖与淀粉的累积促使种子发芽率大大提高。本研究中各激素处理下转子莲种子的发芽率均较低，发芽时间长达2个月，这可能有以下几个方面的原因：一是种胚可能与东北铁线莲相似存在胚后熟的过程，当该过程完成后才能具备发芽的能力[18]；二是转子莲可能与结缕草(Zoysisjaponica)、Sandersoniaaurantiaca和细叶鸢尾(Iristenuifolin)等[24-26]植物相似，其种子体内含有某些物质抑制种子萌发；三是转子莲种胚对试验中使用的外源激素种类不敏感[27]，种子内源激素及相关酶的含量变化不明显。导致转子莲发芽率低的原因及如何提高转子莲种子的萌发能力有待进一步研究。

由于植物种类的差异，不同植物种子萌发适宜的激素种类不同，同属植物间适宜的激素浓度范围也大不相同[27]。本研究发现，6-BA对转子莲、大叶铁线莲及齿叶铁线莲种子萌发均存在一定抑制作用，GA3较6-BA更有利于3种种子的萌发，这与野菊花(Dendranthemaindicum)、羊草(Leymuschinensis)和粉绿铁线莲(C.glauca)等种子[28-30]的研究结果相似。高浓度GA3能显著促进大叶铁线莲种子萌发(P<0.05)，而低浓度的6-BA或GA3更有利于棉团铁线莲和齿叶铁线莲种子萌发，这与女萎(C.apiifolia)、毛蕊铁线莲(C.lasiandra)和山木通(C.finetiana)等[31]铁线莲属植物种子的研究结果相似。4种植物对激素种类及浓度的敏感性均存在差异。一定范围的激素浓度能提高种子活力，促进种子萌发。当激素浓度高于或低于该范围时，可能会使种子内部生理平衡被打乱，从而抑制种子萌发。

本研究中，大叶铁线莲种子发芽过程中并未出现发芽不稳定的情况，且发芽率相对较高，这与王娜等[32]研究结果不一致，可能是由于去除果皮过程中减少了空粒或发育不良的种子对试验的影响。5 mg·L-1GA3和500 mg·L-1GA3分别为齿叶铁线莲和棉团铁线莲种子萌发最适浓度，该结果与王非等[33]结论一致，但与其所得发芽率及发芽势相差较大，可能与本研究去除果皮并使用蒸馏水而非激素处理液保湿有关。

与对照相比，一定程度的温水浸种及激素处理均能显著提高棉团铁线莲及齿叶铁线莲种子发芽率(P<0.05)，因此在实际育苗过程中可以考虑两种方法结合使用，进一步促进种子萌发。对于转子莲而言，尽管激素处理在一定程度上能显著提高转子莲种子的发芽率(P<0.05)，但与对照相比种子发芽率提高幅度仍较小，因此在转子莲的育苗过程中建议使用温水浸种的方式。大叶铁线莲种子在清水处理或25 ℃温水浸种下发芽率均高达80%，因此育苗过程中采用25 ℃温水浸种即可。

本研究基本明晰了浸种温度及两种激素对4种铁线莲属植物种子萌发特性的影响，为今后4种铁线莲属植物的资源保存、种苗繁育、杂交育种等提供了一定的理论依据。