功能化聚合物基质整体色谱柱的研究进展

彭 坤，吴慧慧，李 林，王启钦，于 沛，江正瑾*

(1.暨南大学 药学院 药物分析研究中心，广东 广州 510632；2.暨南大学 药学院 新药研究所，广东 广州 510632；3.安徽省第二人民医院(安徽省职业病防治院)，安徽 合肥 230022)

液相色谱作为一种重要的分离分析手段，广泛应用于化学、生命科学和药学中。近年来，随着分离理论和分析软件硬件的快速发展，各种液相色谱-质谱联用技术手段越来越先进。但由于新药研发、蛋白质组学分析、中药有效成分分析等领域的快速发展，色谱分析技术仍面临众多新的挑战。色谱柱作为色谱分析技术的核心，一直是色谱领域的重要研究对象。传统硅胶基质填充色谱柱(粒径为3～5 μm)存在pH适用范围窄(pH=2.0～8.0)、传质阻力大、通透性较差、制备工艺复杂及成本高等不足；近年来，粒径为1～2 μm的填料迅速普及，它可显著提高柱效和缩短分析时间，但随填料粒径的减小柱背压急剧上升[1]。因此，开发高效快速、高选择性且制备方法简单的新型色谱分离材料，仍然是分析科学及材料科学等领域的重点研究方向。

整体固定相是采用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相，与传统硅胶固定相相比，具有制备工艺简单、内部结构均匀、通透性好、传质速度快、pH适用范围宽、易于修饰和可进行高效快速分离等优点，现已被广泛应用于微径液相色谱(CLC)、电驱动色谱(CEC)及样品前处理等方面，因此被称为继多聚糖、交联与涂渍及单分散固定相后的“第四代色谱材料”[2]。基于材质的不同，目前整体柱可分为硅胶基质整体柱、有机聚合物基质整体柱及有机无机杂化基质整体柱。20世纪90年代初，Tanaka教授课题组通过溶胶-凝胶法制备出无机基质的整体柱[3]，其具有机械强度高、化学性能稳定、比表面积大等特点；尤其是其骨架分布均匀且结构接近灌流色谱填料，通孔和介孔可分步控制，同时具备高通透性和高柱效的特性，因此可用于复杂样品中小分子和生物大分子的高效快速分离[4]。然而，硅胶基质整体柱存在制备过程复杂耗时、在生物样品分离分析时拖尾现象及吸附作用较严重等不足，且其制备技术被少数研究人员掌握，并存在严格的专利壁垒，从而限制了其进一步发展与应用。2000年，Hayes等[5]首次通过溶胶-凝胶法制备出有机无机杂化整体柱，该类整体柱结合了硅胶整体柱和有机聚合物整体柱的优点，成为整体柱未来发展的重要方向之一[6-10]。但其研究仍处于探索阶段，如反相作用机理的杂化整体柱对复杂样品的分析能力尚不足，因此需发展新型制备方法和功能单体来改善其形貌均匀性、提高柱效及对酶解产物或代谢物等复杂样品的分离分析能力。

有机聚合物基质整体柱是由功能性单体、生孔剂、交联剂及引发剂的混合物在预烯基化的毛细管柱内部通过自由基引发原位聚合而成的连续床固定相，反应完成后通过高压泵泵入甲醇等极性溶剂去除未反应的试剂，最终得到具有通孔和中孔的聚合物整体柱(图1)[11-14]。理想的有机聚合物整体柱内部通常呈现三维网络骨架和多孔结构。有机聚合物整体柱的孔尺寸大小和分布[15]、骨架结构等均与聚合溶液的组成及反应时间和温度密切相关，制备过程中需对这些影响因素进行系统优化。

图1 有机聚合物基质整体柱的制备流程Fig.1 Schematic diagram for the preparation process of polymer monolithic column

由于具有制备过程简单可控、通透性好、传质速度快、生物兼容性好、极端pH条件下稳定、可供选择的单体种类丰富、易于修饰等优点，目前有机聚合物整体柱的制备及应用研究在整体柱研究中占很大比重，并已被广泛应用于蛋白质组学分析、生物大分子分离富集、临床化学和环境污染物分析等领域[1]。

根据制备所用单体和交联剂化学结构的不同，有机聚合物整体柱可分为：聚丙烯酰胺类整体柱、聚苯乙烯类整体柱、聚甲基丙烯酸酯类整体柱[16]。其中，聚甲基丙烯酸酯类整体柱的功能性单体选择范围广，且在pH 2.0～12.0范围内稳定性良好，从而更易获得最佳的色谱性能和广阔的应用范围，成为当前研究最为广泛的有机聚合物基质整体柱[17]。

Svec教授[18]认为当下整体柱发展的主要方向为：(1)开发新的制备方法以获得高柱效的整体柱；(2)开发不同功能化的新型整体柱；(3)拓宽整体柱的应用范围。其中，整体柱的功能化是保障其高柱效和应用范围的基石。在以往20年中，伴随着有机化学等领域的高速发展，越来越多不同种类的新单体或功能性化合物被开发，极大地促进了功能化整体柱的研究进展。本文对近年来有机聚合物整体柱的功能化研究进行了综述。

1 有机聚合物基质整体柱的功能化研究

随着各种不同官能团修饰单体或修饰方法的出现，有机聚合物整体柱的功能化研究进展顺利，反相整体柱、亲水整体柱、手性整体柱及亲和整体柱等已有大量报道，并成功应用于生物医药、食品分析等研究领域[18- 19]。

1.1 反相整体柱

根据流动相和固定相的相对极性不同,可将液相色谱分为正相色谱和反相色谱。流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱，非极性键合相色谱常被作为反相色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最广泛，目前70%以上的液相色谱分析是在反相色谱固定相上进行。常见的反相色谱固定相有C18柱、C8、C4、苯基和氰基柱等，通常用于疏水性物质分析[20]。但由于硅胶颗粒在pH>8.0时不稳定，同时硅醇基对生物大分子的非特异性吸附严重，因此有机聚合物反相整体柱的研究首先得到了迅速发展。1993年，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)整体柱被开发用于生物大分子分离，至今已有含不同非极性官能团(乙烯基、苯乙烯基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、丙烯酰胺等)的整体材料被报道[21-24]。Svec教授等[25]以甲基丙烯酸丁酯(BMA)为功能性单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，光引发聚合制备了poly(BMA-co-EDMA)整体柱，发现其可在40 s内快速分离细胞色素c、肌红蛋白、核糖核酸酶A和卵清白蛋白。该柱现已被Thermo公司商业化，促进了反相聚合物整体柱的发展。

1.2 亲水整体柱

亲水作用液相色谱(HILIC)被称为“反反相”色谱，与传统的反相色谱法相反，其固定相为极性物质，流动相中的水相表现为强溶剂。HILIC是目前保留和分离极性化合物最成功的方法。近10年中，受到制药行业中极性药物开发以及代谢组学领域的推动，HILIC已变得日益流行(图2)。各种商业化和自制的HILIC材料日益丰富，其中有机聚合物HILIC整体柱因具有制备工艺简单可控、通透性好、传质阻力低等优点成为新一代HILIC柱中的佼佼者[26]。目前已有一系列含不同极性官能团(如羟基、氨基、氰基、磺酸根、羧酸根、两性离子等)的有机聚合物HILIC整体柱被开发，并成功应用于蛋白质、多肽、DNA、核苷酸、糖类、小分子极性化合物甚至蛋白质消解物的分离分析[27]。

图2 HILIC整体柱的发展趋势和分离机理Fig.2 Development trend and separation mechanism of HILIC monolithic column

HILIC整体柱的发展早期，丙烯酰胺类[28]整体固定相已有报道，但因单体可变性小且大部分存在类似商品化填充柱，因此未受关注。相对于丙烯酰胺类HILIC整体柱，甲基丙烯酸酯基质的HILIC整体柱具有以下优势：商业化亲水性单体选择范围宽；整体柱表面可通过不同方法进行改性从而提高材料表面的亲水性。常见的亲水性功能性单体有甲基丙烯酸羟乙酯[29]、2-甲基丙甲酸[30]、4-乙烯基苯硼酸[31]、甲基丙烯酸缩水甘油酯[32]、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐[33]、3-磺丙基甲基丙烯酸酯[34]等。近年来，其他新型功能化HILIC柱也被开发，尤其是两性离子官能团修饰的有机聚合物HILIC整体柱因存在高效、高选择性的亲水作用及与带电分析物之间的弱静电作用而备受关注，其中具有代表性的是甜菜碱[35]和磷脂酰胆碱类功能性单体[36]。本课题组近年来采用不同两性离子功能单体[37-41](图3)，制备了一系列有机聚合物HILIC整体柱。课题组还研究了不同交联剂制备甜菜碱功能化HILIC整体柱的差异，发现交联剂的极性对所制备整体柱的亲水性、选择性及柱效等影响显著。除甜菜碱类化合物外，磷脂酰胆碱类单体是另一种非常重要的两性离子化合物。本课题组以2-甲基丙烯酰羟乙基磷酰胆碱(MPC)、2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯(MBP)为功能单体，EDMA为交联剂分别制备了poly(MPC-co-EDMA)和poly(MBP-co-EDMA)整体柱，已成功应用于极性化合物的分离，并进行了选择性和色谱性能的对比[40-41]。

图3 两性离子功能单体Fig.3 Zwitterionic functional monomers

尽管已有一系列商品化的硅胶基质HILIC固定相和各种功能化的HILIC整体材料被报道，但由于HILIC作用机制的复杂性和多样性，其分离理论尚不明确。发展新型HILIC固定相，探究HILIC的作用机理，是HILIC整体材料未来发展的方向之一。

1.3 手性整体柱

在新药研发中，超过50%的药物活性成分有光学活性[42]。尽管手性对映体具有相同的物理化学性质，但它们的药理和毒理作用通常不同甚至相反。因此，手性对映体的定性定量分析受到了科学家和监管部门的高度重视。近年来已有蛋白质、纤维素、环糊精、大环抗生素、氨基酸及MOFs等聚合物手性整体柱被开发用于手性样品的分离分析[43]。

1.3.1蛋白质手性整体柱目前，以不同蛋白质(HSA、BSA、AGP等)为手性选择剂的聚合物整体柱已有不少研究报道[44]。其制备过程常采用poly(GMA-co-EDMA)为基质整体柱，然后通过开环反应在基质柱表面键合上目标蛋白作为手性固定相，这些手性整体柱已成功应用于DL-氨基酸等手性化合物的拆分[45]。但蛋白质聚合物整体柱存在手性识别机理复杂、聚合物表面蛋白键合量低等缺点,限制了其进一步发展。

1.3.2多糖手性整体柱在早期研究中，几种多糖衍生物，如三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)纤维素(CDMPC)等被最先制备成硅胶整体柱用于CEC或CLC手性分离[46-47]。为克服硅胶整体柱的不足，邹汉法等[48]将CDMPC涂覆到有机聚合物基质材料上，制备出的纤维素修饰的聚合物手性整体材料表现出良好的化学稳定性和手性拆分能力。但是由于多糖杂化基质手性整体柱的快速发展[49]，其聚合物基质整体柱的研究比较有限。

1.3.3环糊精手性整体柱环糊精(CD)特别是β-CD及其衍生物是色谱固定相中发展迅速、应用广泛的一类手性选择剂，并已衍生出多种商品柱。其手性识别机制通常涉及CD疏水空腔包埋作用、葡萄糖单元的手性识别作用及衍生化基团与分析物之间的额外增量等[50]。1998年，Koide和Ueno[51]开创性地制备出首款β-CD修饰的有机聚合物整体柱，在CEC模式下用于阳离子和中性化合物的手性分离。随后，为提高环糊精整体柱的手性识别能力和柱效，整体柱的制备方法、聚合物基底与单体之间连接链的长度与种类、环糊精的改性修饰和交联剂种类等多个因素均被考察[52-55]。至今，已有不同种类环糊精功能化整体柱被开发[56-59]。但相对于硅胶填充柱，环糊精修饰聚合物整体柱的手性识别能力较为有限，需对上述各影响因素进行深入研究。

1.3.4其他手性整体柱大环抗生素常作为一类有效的手性选择剂，用于HPLC、CE及CEC中[60]。万古霉素[61]、瑞斯托霉素、替考拉宁等已被制备成相应的聚合物手性整体柱。2001年Kornyšova等首次制备了万古霉素修饰的手性整体柱，在10 min内即可实现沙利度胺对映体的快速拆分，柱效高达120 000 plates/m[62]，但该色谱柱无法实现大部分β-阻断剂的手性拆分[63]。此外，冠醚[64]、氨基酸[65]、分子印迹[66]或配体交换[67]类的聚合物手性整体柱近年来也有报道。

1.4 亲和色谱柱

图4 亲和色谱的典型洗脱策略[70]Fig.4 A typical on/off elution scheme used in affinity chromatograph[70]

亲和色谱是一种非常重要的高选择性分离手段，现已广泛应用于复杂样品的纯化、富集及定性定量分析。其作用机理是目标分析物与色谱载体表面的亲和识别配体产生专一的相互作用，从而达到与其它杂质分离的目的(图4)。近年来，孔隙度高、非特异性吸附少的功能化聚合物亲和整体柱在生物大分子的特异性富集和纯化中受到了广泛关注[68- 69]。其中，比较常见的是利用poly(GMA-co-EDMA)基质整体柱，通过各种方法将不同亲和识别配体(如：抗体、蛋白质A/G、凝集素、抗原、L-组氨酸、胰蛋白酶、核酸适配体、亲和小肽、染料及血清蛋白等)固定于基质柱表面用于识别目标分析物或制备高效固定化酶反应器等[70]。其他发展比较快速的亲和色谱材料，如硼酸亲和整体柱、固定化金属亲和色谱(IMAC)整体柱等，现已广泛应用于糖蛋白或磷酸化蛋白组学分析等领域。

1.4.1硼酸亲和整体柱在糖蛋白组学分析中，由于大量的非糖蛋白与糖蛋白同时存在于样品中，采用常规的分离方法进行组学分析时可能会掩盖低丰度糖蛋白，很难将非糖蛋白除尽，因此需要高特异性的手段对复杂样品中的低丰度糖蛋白进行纯化、富集和再检测[71]。近年来，基于硼酸及其衍生物可以高选择性地富集含有顺式二醇结构化合物的原理，硼酸功能化亲和色谱整体柱的研究成为亲和色谱研究领域中的热点。至今，已有4-乙烯基苯硼酸、3-丙烯酰胺基苯硼酸、4-(3-丁烯基磺酰基)苯硼酸、对羟基苯硼酸、3-(二甲基氨甲基)-苯胺-4-硼酸频哪醇酯、2,4-二氟-3-甲酰基苯基硼酸、间氨基苯硼酸、2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸等不同类型的硼酸功能化亲和整体柱被报道，并应用于糖蛋白、核苷、糖肽、儿茶酚等顺式二醇类化合物的分离和富集中，大大拓展了亲和整体柱在复杂样品分析中的应用范围[72]。但硼酸亲和整体材料对均含有顺式二醇结构的化合物区分能力不足，且不能特异性捕获含特定糖型结构的糖蛋白，因此通常需借助其他特异性高的富集手段(如：凝集素等)来实现特定糖型糖蛋白和糖肽的富集[73]。

1.4.2固定化金属亲和整体柱磷酸化蛋白质在细胞功能调控、信号传导及代谢调节等生命活动中起到重要作用。但磷酸化蛋白/肽在目标样品中含量通常较低，质谱分析时易受到大量非磷酸化蛋白/肽的干扰，因此需对样品中的磷酸化蛋白/肽进行高特异性纯化、富集。

近年来，基于金属离子与目标分子(如氨基酸、肽、蛋白、核酸等)之间特异性亲和作用的固定化金属亲和整体柱在磷酸化蛋白/肽的高选择性富集中得到了广泛应用[74]。研究发现，即使在复杂样品基质中固定化金属整体材料依然表现出良好的富集速率和优秀的富集能力。常见的固定化金属离子有Ni2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Ti4+、Zr4+、Ga3+等[75-76]。但是基于金属离子与特定官能团之间相互作用的固定化金属亲和色谱法难以区分含有相同特定官能团的不同蛋白样品，且存在损坏蛋白骨架结构、金属离子泄漏产生毒性、蛋白纯化后需额外手段脱除组氨酸标签进而污染最终产物等缺点[77]。

1.4.3小肽亲和整体柱在抗体富集过程中，传统的超滤、蛋白沉淀以及固相萃取等纯化方法由于特异性不强，在抗体富集中的应用报道较少[78]。抗原与抗体的反应具有专一性，因此以特异性抗原或抗体药物靶标蛋白为亲和配体，对抗体药物进行免疫亲和纯化富集具有很高的选择性。然而由于特异性抗原难以获取或价格昂贵，该富集方法实际推广价值不大。蛋白质A和蛋白质G价格相对低廉，近年来被用于纯化富集含IgG抗体Fc片段的抗体药物[79]。但蛋白质A/G存在易降解、易脱落、对pH值敏感，结合作用过强易破坏抗体蛋白空间结构，使用寿命短的缺点，且用于样品前处理时难以消除内源性IgG的干扰。

随着组合化学的发展以及对组合肽库的深入探索，科学家发现一些特异性小肽可作为亲和配体固定于整体柱表面，并在生产过程中大量纯化IgG或抗体(图5A)[80]。例如杜开峰[80]报道了一种六肽固定的触须式聚合物整体柱，能够很好地从人血浆中分离纯化人体IgG。本课题组首次利用金属螯合多步法制得3,5-二特丁基-4-羟基苯甲酸取代天冬氨酸-天冬氨酸-甘氨酸(DAAG)特异性小肽功能化的亲和整体柱，该整体柱可用于赫赛汀细胞培养液中赫赛汀和人血清中IgG的高效富集纯化[81]。与生物特异性蛋白亲和配体(如蛋白质A/G)相比，小肽配体的价格低、化学性质稳定、不含生物杂质、无免疫原性、洗脱条件非常温和、不破坏抗体蛋白的构象、使用寿命长；此外通过分子模拟等方法设计或筛选与抗体药物的抗原结合片段(Fab 区)特异性结合的亲和肽，可解决蛋白质A/G 配体对抗体药物和IgG 区分能力不足的缺陷[82]。因此，基于高亲和小肽配体的亲和整体柱有望在抗体药物纯化、富集中得到广泛应用。

图5 常见的抗体纯化方法：亲和色谱法(A)[80]；亲和沉淀法(B)[76]Fig.5 Common methods for antibody purification:affinity chromatography(A)[80] and affinity precipitation(B)[76]method

2 展 望

至今，不同作用机理的聚合物基质整体色谱柱已被设计开发，并在药学、生命科学和环境科学等领域展现了突出的应用价值。聚合物整体色谱柱在微分离系统中应用的独特优势，如：高柱效、高速和高通量，使其特别适用于复杂生物样品的分离分析，为蛋白质组学、代谢组学等领域的发展提供了高效色谱介质。但聚合物整体色谱柱的制备方法、表面官能团的种类和应用等方面仍有较大的拓展空间。开发新型制备方法和手段[83]以确保整体色谱柱的高重现性，丰富整体柱的功能性以满足复杂基质样品分离分析的需求，拓展聚合物基质整体柱的应用范围，成为未来聚合物基质整体色谱柱研究的重要方向。例如在聚合物基质整体柱改性方面，近年来已有金属纳米粒子(金、银、铂、钯、铁和γ-氧化铝等)修饰的聚合物整体柱被用于特异性捕获含特定官能团的化合物[84]。碳纳米管[85-87]，尤其是石墨烯或氧化石墨烯功能化的聚合物整体柱也被开发；更为值得重视的是，近年来功能多样性的有机金属框架材料在整体柱研究领域也得到了快速发展[88]，有望开拓出整体柱的新发展方向。综上所述，通过发展新的制备手段、优化制备条件和过程、开辟新的应用领域，聚合物基质整体色谱必将大有可为。