急性烟雾吸入性肺损伤对大鼠凝血系统的影响

宋立成，韩志海，程浩，奂剑波，陈丽娜，孟激光，陈旭昕，解立新

烟雾吸入性肺损伤是战时或平时火灾现场常见的创伤，其严重后果是发生急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，病死率较高[1]。尽管近年来吸入性损伤及后续康复治疗取得了很大的进步，相关病死率仍居高不下[2-4]。多种类型的急性创伤状态下普遍存在凝血功能紊乱[5-9]，但由于致伤因素不同，且凝血功能紊乱本身的促凝-抗凝路径复杂，不同病因导致的凝血功能紊乱状态也存在差异[8,10-12]。单纯烟雾吸入性损伤作为急性肺损伤的一个重要组成部分，虽然有较多肺部局部凝血功能紊乱的相关研究[13]，但对其全身凝血功能紊乱途径研究仍较缺乏，特别是内源性抗凝途径在烟雾吸入性损伤中的变化仍有诸多研究空白。本实验通过建立单纯烟雾吸入性肺损伤模型，探究其全身凝血功能特别是内源性抗凝途径的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康成年雄性SD大鼠160只(8～12周龄)，体重180～220g，由军事医学科学院实验动物中心提供，海军总医院实验动物中心饲养，饲养环境温度20～25℃，相对湿度50%～70%，各组大鼠体重差异无统计学意义。遵守实验动物条例处置动物，实验过程经海军总医院伦理委员会审核批准。

1.2 实验装置 采用自行研制的密封性良好的产烟装置与实验装置一体化的集成系统，主要组成部分为烟雾生成单元(不锈钢材质，内含1个控温电磁炉、4个排风扇、1个温度检测器、1个烟雾成分检测器)及动物染毒单元(不锈钢材质，包含1个水循环冷却系统，可控制箱内温度于20～25℃；1个温度检测器；1个烟雾成分检测器；单侧箱体为玻璃材质，可实时监测箱内动物活动状态)。两个单元通过联通管道相连。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组和处理 160只实验大鼠随机分为实验组(n=120)和对照组(n=40)；根据本研究前期预实验结果，大鼠稳定烟雾吸入30min生存率为25%～35%，随机选取120只大鼠进行烟雾吸入实验，按照时间顺序将存活大鼠分为1、6、24、48h四组，进行生存率观察，并在各个时间点随机选取6只大鼠，用戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，经腹主动脉放血致死，取肺组织、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、外周血；对照组40只大鼠随机分为4组，每组10只，在实验组各对应时间点采用相同处理方式进行标本采集。

1.3.2 烟雾吸入方案 采用聚双马泡沫材料、发泡橡塑绝热制品、阻燃白胶、阻尼材料、无卤电缆、硅丙乳胶漆、装饰板7种火灾易燃材料作为发烟材料。将上述发烟材料研磨成粉，等比例混合(各20g)后，置于电磁炉上方的托盘中，控制电磁炉温度为300℃，待产烟箱中烟雾充盈后用排风机将烟雾通过管道排入实验箱中，同时用烟雾检测仪检测箱内气体的浓度，各种气体控制范围为：CO 400～550ppm，H2S 10～15ppm，O218%～20%，上述成分的含量通过控制排风机进行维持。

1.3.3 血气分析 将大鼠麻醉后，暴露腹主动脉用血气针进行采血检测动脉血气，检测指标为pH、氧分压、二氧化碳分压、碳氧血红蛋白、乳酸。

1.3.4 BALF及肺组织的收集 大鼠通过戊巴比妥麻醉后，沿胸骨中线开胸，结扎右肺，对左肺用1ml冷PBS进行灌洗，共4次。获得的BALF在4℃下1000r/min离心3min，收集细胞沉淀进行细胞计数及分类，上清液继续于4℃下3000r/min离心15min，离心后获得的上清液采用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Scientific，USA)检测蛋白含量。收集右肺上叶存储于液氮中，右肺下叶存储在4%多聚甲醛中，以备后续检测。

1.3.5 病理损伤评估 对右肺主支气管进行结扎后，收集右肺下叶于4%甲醛固定液中，48h后进行石蜡包埋，然后进行切片，厚度为6μm，脱蜡后进行HE染色，通过单盲法由两名病理科医生光镜下进行组织学观察评分。采用美国胸科学会(American Thoracic Society，ATS)制定的肺损伤评分标准，参数包括肺泡内中性粒细胞计数、肺泡间隔内中性粒细胞计数、透明膜形成与否、肺泡腔内是否残存蛋白质、肺泡间隔的厚度。每名病理科医生对每张切片至少选取20个随机高倍视野(400×)进行评分。

1.3.6 全身凝血功能检测 大鼠麻醉后，经腹主动脉取血，按比例混合于含枸橼酸钠抗凝剂的采血管中，4℃下3000r/min离心15min，对上清液进行常规凝血功能检测，指标包括凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、国际标准化比率(international normalized ratio，INR)、纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)、凝血因子Ⅷ活动度(factor Ⅷ%，FⅧ%)，抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，ATⅢ)，通过凝血仪(Sta-R Evolution System，Diagnostica Stago，USA)测定。血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)、凝血因子Ⅱ(FⅡ)、FⅤ检测：上述方法获得抗凝血浆后，采用TM、FⅡ、FⅤ三种因子的ELISA试剂盒(GenXspan，USA)按照说明书进行检测。通过发色底物法检测上述血浆中的蛋白C活性。

1.3.7 局部凝血功能检测 大鼠肺泡灌洗后获得BALF，采用ELISA试剂盒(GenXspan，USA)对其中的ATⅢ、TM、FⅡ、FⅤ、凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex，TAT-c)进行检测。

1.4 统计学处理 采用 SPSS (Version 24.0，IBM Co.，USA)软件进行分析。计量资料以±s表示，经方差齐性检验后，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时进一步两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生存率及肺损伤评估 烟雾吸入后，大鼠总体生存率为35.15%，其中烟雾吸入后的前6h内生存率变化最明显(51.35%)，且死亡前具有共同特点，即急性肺水肿导致的窒息现象，表现为剧烈躁动、喘息样呼吸、口鼻大量鲜红色水肿液渗出；解剖后发现严重肺水肿、肺出血，且大量水肿液阻塞主气管。肺组织病理切片可见烟雾吸入后肺泡内广泛的出血和炎性细胞浸润，肺间质增宽，大量水肿液弥漫于肺泡中(图1A)。烟雾吸入后1h肺损伤评分(4.809±1.808)明显高于对照组(1.185±0.360，P＜0.001)，且持续至48h仍高于对照组(图1B)。烟雾吸入后1h BALF中的白细胞总数明显升高[(15.100±2.899)×109/L]，与对照组[(0.725±0.164)×109/L]比较差异有统计学意义(P＜0.001)，且此后各时间点均明显高于对照组(P＜0.001，图1C)。烟雾吸入后1h BALF中的蛋白含量(945.248±135.671μg/ml)明显高于对照组(280.386±107.240μg/ml，P＜0.001)，且此后各时间点均明显高于对照组(P＜0.001，图1D)。

图1 组织病理、细胞学、蛋白质检测评估肺损伤严重程度Fig.1 Severity of lung injury evaluated by histopathology, cytology and protein test

2.2 动脉血气分析 烟雾吸入后1h实验组pH明显低于对照组(P＜0.05)，但6h后已恢复正常。实验组于烟雾吸入后1h，氧分压下降(P＜0.01)，第6h氧分压继续下降；碳氧血红蛋白(COHB)于烟雾吸入后立即升高，1h为最高值(P＜0.01)，6h后明显下降(P＜0.05)，12h与对照组相比差异已无统计学意义(P＞0.05)；二氧化碳分压的变化与氧分压变化的趋势相同。动脉血乳酸于烟雾吸入后1h内明显升高(P＜0.01)，但6h后基本恢复正常，与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

表1 烟雾吸入后动脉血气指标的变化(±s，n=6)Tab.1 Changes of arterial blood gas indexes after smoke inhalation (±s, n=6)

表1 烟雾吸入后动脉血气指标的变化(±s，n=6)Tab.1 Changes of arterial blood gas indexes after smoke inhalation (±s, n=6)

PCO2. Partial pressure of carbon dioxide; PO2. Partial pressure of oxygen; Lac. Lactate; COHB. Carboxyhaemoglobin; (1)P＜0.01, (2)P＜0.05 compared with control group

Group pH PCO2(mmHg) PO2(mmHg) Lac COHB(%)Control group 7.394±0.044 40.100±6.986 101.907±14.804 1.970±0.973 0.179±0.058 Experimental group 1h 7.298±0.123(2) 55.091±12.571(1) 75.094±12.573(2) 3.824±1.901(1) 11.753±1.735(1)6h 7.349±0.069 46.294±16.686 74.541±19.359(2) 1.465±0.231 0.506±0.186(2)24h 7.346±0.061 45.036±12.041 85.146±8.337(2) 1.521±0.182 0.246±0.069 48h 7.405±0.051 43.633±6.490 83.350±15.626(2) 1.482±0.562 0.211±0.068

2.3 局部凝血功能的变化 对BALF中的凝血因子进行检测发现，FⅤ于烟雾吸入后1h明显低于对照组(9.83±3.43ng/ml vs. 22.04±8.11ng/ml，P=0.002)，此后各时间点虽然有缓慢恢复，但与对照组相比差异仍有统计学意义(P＜0.05，图2A)；FⅡ于烟雾吸入后呈逐渐降低趋势，6h后与对照组比较差异有统计学意义(92.62±4.44ng/ml vs.98.69±3.08ng/ml，P=0.039，图2B)；BALF中TAT-c于烟雾吸入后有逐渐升高的趋势，6h后与对照组比较差异有统计学意义(2.256±0.335ng/ml vs.1.901±0.141ng/ml，P=0.042)，此后持续升高(图2C)。烟雾吸入后BALF中的ATⅢ虽然表现出逐渐降低的趋势，但是与对照组相比均无明显差异(P＞0.05，图3A)；烟雾吸入后1h BALF中TM明显低于对照组(1.945±0.161ng/ml vs. 2.978±0.120ng/ml，P＜0.001)，此后各时间点虽有升高趋势，但仍明显低于对照组(图3B)。相关性分析显示，BALF中的TM水平与肺损伤评分呈显著负相关(r=-0.847，P＜0.001，图3C)。

2.4 总体凝血功能的变化 总体凝血功能指标包)括PT、INR、APTT和FIB。实验组INR和PT虽然在烟雾吸入后呈现波动，但在各时间点与对照组相比无显著性改变(P＞0.05，图4A、B)，而APTT在烟雾吸入后1h即显著升高(P=0.004)，此后逐步恢复到正常(图4C)；FIB总体呈现缓慢上升趋势，在烟雾吸入24h与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.001)，48h后下降至正常(图4D)。

图2 烟雾吸入后肺泡灌洗液中凝血因子的变化Fig.2 Changes of coagulation factors in BALF after smoke inhalation

图3 烟雾吸入后肺泡灌洗液中抗凝因子的变化Fig.3 Changes of anti-coagulation factors in BALF after smoke inhalation

图4 烟雾吸入后不同时间总体凝血功能的变化Fig.4 Changes of total coagulation function after smoke inhalation

2.5 循环中多种凝血因子的变化 对促凝途径共同通路中重要的因子FⅤ和FⅧ进行检测发现，烟雾吸入后外周血中FⅧ的活性逐渐降低，6h降至最低点(P=0.049)，此后逐渐升高，恢复至正常(图5A)。烟雾吸入后1h外周血中FⅤ即明显降低(P=0.022)，此后呈继续降低的趋势(图5B)。FⅣ为Ca2+，通过血气分析仪测定动脉血中Ca2+的变化趋势，结果显示，烟雾吸入后Ca2+浓度逐渐降低，至24h明显低于对照组(1.223±0.057mmol/L vs.1.280±0.086mmol/L，P=0.043，图5C)。凝血酶原(FⅡ)可在FⅧa、FⅤa及Ca2+的作用下活化为FⅡa，即凝血酶，通过ELISA检测发现，烟雾吸入后FⅡ呈现逐步升高趋势，但与对照组比较差异均无统计学意义(图5D)。FⅡ没有显著改变却伴有FⅣ、FⅤ和FⅧ的减少，并且PT也无显著改变，提示存在拮抗途径有效拮抗了凝血酶的形成。

2.6 血小板计数的变化 通过血常规分析仪检测外周血血小板含量变化，结果显示，实验组烟雾吸入后1h血小板明显高于对照组(1230.25±156.09 vs.1027.14±126.25，P=0.014)，此后逐渐降低，与对照组比较差异无统计学意义(图6)。

2.7 天然抗凝途径主要因子的变化 发色底物法检测显示，实验组烟雾吸入后外周血蛋白C的活性明显下降，1h与对照组比较差异有统计学意义(P=0.032)，6h降至最低(P=0.002)，此后持续低于对照组(图7A)；ELISA检测外周血中TM的变化显示，烟雾吸入后外周血TM呈逐步升高的趋势，6h开始明显高于对照组(P=0.012)，此后持续增高(图7B)。对血浆ATⅢ的检测发现，烟雾吸入后1h即可出现ATⅢ活性的明显降低(P=0.007)，此后ATⅢ的活性逐步恢复到正常水平(图7C)。

3 讨 论

早期研究认为，无论何种原因导致的ARDS局部凝血功能紊乱均是主要通过TF-FⅦa途径启动的[14]。吸入性肺损伤发生后，微血管渗透性增加导致气道水肿加重，大量血浆渗入气道中，导致气道内凝血激活及纤维素沉积，同时烟雾中的毒性气体、微颗粒等导致黏膜上皮严重损伤，细胞碎片、黏膜、纤维素的混合物形成了一层假膜，严重者甚至可出现铸型，加重了气道阻塞以及通气/血流比例失衡[15-16]。气道内大量阻塞性铸型形成导致了肺不张、气道陷闭、肺泡过度膨胀或气压伤及后续产生的肺炎等表现[17]。本课题组前期实验发现，烟雾吸入后短期内可导致肺泡内广泛的水肿、出血、炎症细胞浸润及上皮细胞脱落，BALF中可见大量炎性细胞及脱落的上皮细胞和蛋白沉积物等。本次实验对局部凝血功能紊乱的研究发现，烟雾吸入后存在BALF中FⅡ、FⅤ等凝血因子的消耗，FⅤ为凝血酶原转化为凝血酶的重要物质，FⅡ的降低提示FⅡ向FⅡa的转化增多，此外，BALF中TAT-c明显升高，但ATⅢ的含量无显著变化，提示ATⅢ途径并没有有效抑制促凝过程，所以肺泡内的凝血功能紊乱以促凝为主要特点。

图5 循环中多种凝血因子的变化Fig.5 Changes of coagulation factors in circulation

图6 烟雾吸入后外周血血小板的变化Fig.6 Changes of platelets in circulation after smoke inhalation

图7 烟雾吸入后外周血中抗凝因子的变化Fig.7 Changes of anti-coagulation factors in circulation after smoke inhalation

目前对于烟雾吸入性急性肺损伤导致全身凝血功能改变的研究较少。既往研究表明全身凝血功能紊乱是烧伤、创伤、重症感染常见的并发症，是ARDS的重要病理过程[6,18]；在创伤中还可能存在“急性创伤凝血病(acute traumatic coagulopathy，ATC)”的凝血功能紊乱，其机制是创伤引起的低灌注性休克导致大量凝血酶-血栓调节蛋白复合物形成，引起蛋白C过度激活[19]，活化的蛋白C(activated protein C，APC)可进一步抑制FⅤa和FⅧa，从而引发了一种抑凝状态[20]，其最终以出血为主要临床表现，传统凝血指标表现为PT/INR/APTT延长，而PLT和FIB无明显降低[21-22]。由于目前缺乏单纯烟雾吸入性肺损伤凝血功能异常的研究，本实验的目的是评估烟雾吸入后是否存在ATC。对吸入烟雾大鼠进行解剖后发现，肺大体外观呈现弥漫性出血灶或全肺水肿表现，水肿液镜下观察可见大量的红细胞及炎性细胞，全身其他脏器并未见明显的出血；对凝血三项进行检测发现，与对照组相比，PT、INR并未见明显改变，虽然APTT在烟雾吸入后1h明显升高，但可缓慢恢复正常，此三项虽然有接近ATC的趋势，但尚未达到ATC的标准。本研究发现，烟雾吸入后急性期1h血小板一过性增高，其他各时间点血小板与对照组相比无明显差异，也无降低的趋势。既往一项烧伤合并烟雾吸入损伤的动物模型研究显示，烟雾吸入后会出现血小板先降低(48h)再明显升高(168h)的趋势[23]；另一项研究显示，烧伤合并吸入性损伤在24h后出现血小板计数的明显降低[24]；还有一项文献指出，烧伤合并烟雾吸入性损伤后第1天血小板明显降低，第7天可逐步恢复到正常值下限，考虑血小板降低的原因一方面是因为患者入院48h内给予大量液体复苏造成的稀释性降低，另一方面也存在血小板的过度消耗及生成减少[25]，这与目前公认的脓毒症等危重症疾病中血小板降低的原因分析是一致的[26]。但是本研究中血小板急性期(24h内)变化的原因可能是烟雾吸入后急性期肺部严重水肿，大量体液积聚到肺泡中，导致外周循环的相对浓缩，表现为1h血小板呈升高趋势，待脱离烟雾环境后，机体的代偿及体液的补偿很快纠正了这一点。

ATC一项重要的指标是抗凝途径的过度激活，特别是蛋白C向APC转化的显著增强。蛋白C是一种维生素K依赖性蛋白，可以被凝血酶-血栓调节蛋白复合物在内皮细胞表面激活[27]。本研究显示，烟雾吸入后蛋白C活性呈降低趋势，但随时间推移持续存在，提示大部分蛋白C在烟雾吸入后被激活形成APC，若不能及时补充，到后期可能无法有效抑制凝血酶原的活化，导致机体呈现促凝状态。FⅧ主要参与内源性凝血途径，是FⅨa的辅因子，在Ca2+和磷脂参与下，可以将FⅩ转化为FⅩa，这使FⅧ可以作为一种凝血激活的早期参与因子，并直接影响APTT，本研究也证实了这一点。本研究同时发现，Ca2+在烟雾吸入后表现为逐渐降低的趋势，在24h时间点与对照组比较差异有统计学意义(P=0.043)，但此后逐渐恢复正常；烟雾吸入后FⅧ和FⅤ活性降低，提示烟雾吸入后这两种物质被消耗，转化为活化状态的FⅤa和FⅧa参与促凝途径；由于APC系统的激活，过量产生的FⅤa和FⅧa被失活，从而无法将凝血酶原转化为凝血酶，因此促凝途径无法继续进行，本研究对FⅡ的检测证实了这一点。FⅡ转化为凝血酶需要FⅤa和FⅧa的参与，因为这两种物质被APC中和，FⅡ所代表的凝血酶的生成并未明显增加，PT及INR的变化趋势也支持这一点。上述几种物质的相互作用保证了烟雾吸入后机体的促凝-抗凝循环的平衡，但抗凝因子与促凝因子的长期持续消耗，或可使这种平衡变得非常脆弱，导致出血或血栓形成的风险大大增加。

既往对ARDS、脓毒症或其他类型肺损伤的研究显示，血浆游离TM增高及蛋白C降低提示内皮细胞损伤及天然抗凝系统的破坏[28]，并且与病死率存在显著相关性[14,29-30]。本研究也发现，烟雾吸入后存在外周血中TM逐渐升高的情况，这也反映了血管内皮细胞的损伤情况，而烟雾吸入后BALF中TM水平逐渐降低，且与肺损伤评分呈显著负相关，其原因可能是烟雾吸入导致的肺损伤短期内会使大量水肿液积聚在肺泡中，此时内皮细胞损害导致的TM也会随之进入肺泡中，但是被大量水肿液稀释降低了浓度，并且由于烟雾吸入1h内为内皮细胞损伤的初期，大量的TM尚未经循环进入到肺泡中，当脱离损伤环境后，肺泡及上皮-内皮自我修复屏障的恢复使脱落的TM逐渐减少，这与脓毒症等重症情况下因病原体或致伤因素持续存在导致内皮细胞损伤持续加重有很大不同，本研究中TM在烟雾吸入后降低及其与肺损伤的相关性，或许反映的是肺水肿程度。

本研究通过促凝共同途径及天然抗凝途径中主要因子的变化及相互之间的逻辑关系，系统阐述了一种高致死率单纯烟雾吸入性肺损伤后全身凝血状态的变化情况，早期及时有效地掌握凝血状态，把握时机并制定相应凝血调节方案是有效的治疗策略。