开垦对土壤团聚体含量及微生物群落代谢多样性的影响

杨 磊，王卫超，张凤华

(石河子大学/新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆 石河子 832003)

土壤团聚体作为土壤结构的基本单元，是土壤养分的贮藏库也是土壤微生物的良好生境[1]。不同粒径团聚体的理化性质以及对养分的保持、供应和转化情况均有不同，直接对土壤团聚体中微生物生物量、功能以及多样性产生影响[2]。其组成分布及稳定性受到人为活动的影响，如土地利用变化、农业耕作措施以及施肥等因素的影响[3-4]。弃耕地开垦后棉花秸秆还田，刘威等[5]表明秸秆还田可以增加农田表层土壤>0.25 mm团聚体含量，改良土壤结构。李涵等[6]研究发现秸秆还田可以提高土壤有机碳含量。土壤有机碳与土壤团聚体的形成关系密切[7]，团聚体的形成被认为是主要的土壤固碳方式。不同粒径团聚体在有机碳的保持、供应以及转化起着不同的作用，大团聚体与微团聚体相比对有机碳有更强的保护作用，能够固定更多的有机碳[8]。土壤团聚体是由矿物颗粒在有机物的胶结下形成的，而土壤有机碳含量又影响团聚体的数量及分布。土壤有机碳含量的增加有利于土壤结构的形成及稳定性的增强，所以二者之间关系密切[9]。

土壤微生物与土壤理化性质关系密切，而土壤团聚体和土壤微生物逐渐成为当今研究热点。土壤微生物在土壤团聚体的形成和保持稳定性的过程中起着重要的作用[10]。土壤微生物是组成土壤及整个生态系统的重要部分[11]，是土壤有机质转化、物质循环和能量流动的驱动力[12-13]，在生态系统中起到关键的作用[14]。

土壤微生物多样性是评价微生物群落特征的重要内容，反映了群落总体的动态变化特征[15]，对土壤微生物群落多样性研究分析可以为合理利用资源、解决农田生态系统失衡提供理论依据[16]。土壤微生物群落功能多样性是描述土壤微生物群落特征与功能的重要指标，对评价土壤微生物的生态特征和土壤肥力特征起到至关重要的作用[17]。土壤微生物功能多样性信息对于明确不同环境中微生物群落的作用具有重要意义。微生物功能多样性表现在微生物有多种代谢途径和生理功能，包括底物代谢能力、微生物活性和与N、P、S等营养元素在土壤中转化相关的功能等[18]。Biolog分析法作为研究土壤微生物群落结构和功能多样性的一种简单快速、灵敏度高、分辨力强的方法[15]，在一定程度反映土壤碳源转化和微生物代谢多样性。目前主要用于施肥处理[19]、农作模式[20]、耕作方式[21]等土壤微生物群落的代谢多样性，针对干旱区极端环境条件下农田灰漠土土壤团聚体微生物代谢多样性的研究较为薄弱。

本研究利用Biolog微平板技术，以干旱区盐渍化弃耕地开垦前后土壤团聚体微生物为研究对象，比较开垦前后土壤团聚体微生物的代谢特征变化，旨在探讨开垦对土壤团聚体微生物功能多样性的影响，以期为干旱区盐碱地的改良与利用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地点位于新疆玛纳斯河流域冲积扇缘地带十户滩镇(86.13963°～96.14433°E，44.62470°～44.63020°N)，此地区位于准噶尔盆地南部，身处内陆，远离海洋，干旱少雨，蒸发量较大，年均气温6.6℃，≥10℃的积温可以达到3 490℃，年降水量110～200 mm，年蒸发量1 500～2 000 mm，无霜期148～187 d，属于典型的温带大陆性气候。此地位于冲积洪积扇平原，地下水水位高，不合理的灌溉措施加之强烈的蒸发加剧了盐分的表聚，从而导致了大面积盐渍化土壤。

1.2 试验设计

试验地选择盐渍化严重而弃耕29 a的土地，面积为25 hm2。试验分为2个处理，弃耕地作为对照处理，面积5 hm2，植被覆盖较少，主要植被有柽柳、盐爪爪、花花柴和绢蒿等；在原有弃耕地的基础上人为开垦为棉田距今5年，面积20 hm2，期间连续种植棉花。棉花种植密度为2.4×105株·hm-2，整个生育期灌水10～12次，灌溉方式为膜下滴灌，灌水总量为4 500 m3·hm-2。棉花整个生育期，纯氮(300 kg·hm-2)和纯磷(200 kg·hm-2)均通过膜下滴灌随水施入。棉花收获后，秸秆全量(6 000～7 500 kg·hm-2)还田，同时尿素(150 kg·hm-2)和过磷酸钙(450 kg·hm-2)作为基肥深翻施入土壤。

1.3 样品采集

每一样地内随机布设3个1 m×1 m的样方，去除样方上的凋落物层及土壤动物等，采用自然土壤剖面取样法，自下而上采集40～60 cm、20～40 cm、10～20 cm、5～10 cm、0～5 cm以及0～20 cm两部分土壤团聚体，原状土样装入硬质塑料盒带回实验室，途中避免对原状土的挤压，将土壤样品在室温下风干，使样品达到塑限的程度(含水量20%左右)，用于团聚体分级。0～20 cm土样筛分后迅速放入4℃冰箱保存，用于测定土壤微生物功能多样性。

1.4 测定指标与方法

团聚体分级采用干筛法：风干过程中，沿土壤自然结构轻掰成直径1 cm3左右的小土块，剔除植物根系与石块，待风干后，取土样500 g，通过一套筛组,孔径依次为5，2，1，0.25，0.053 mm，筛组上方有盖，下方有底，筛分时间10 min，筛分结束后，测量各孔径筛子上土样重量Wdi，计算各级团聚体占土样总量的百分比。

0～20 cm土壤筛分后将土壤湿度调节为田间持水量的50%，在25℃下预培养7～10天后，迅速测定土壤微生物功能多样性或在低温(4℃)下保存。

土壤微生物功能多样性：采用Biolog-ECO微平板法测定。称取经团聚体分级后相当于10 g烘干土重的土样，加入100 ml无菌PBS缓冲液(NaCl: 0.67%, KH2PO4: 0.024%, Na2HPO4·7H2O: 0.086%, 调节pH)的三角瓶中，塞入无菌棉花，在180 r·min-1下振荡2 h，吸取0.5 mL土壤悬浮液用PBS缓冲液定容到50 mL(即释至10-3)再震荡30 min，通过排孔加样器将稀释液接种至Biolog微平板上，每孔接种量150 μL，3个重复接种于同一微平板上。将接种好的ECO 板置于保湿的无菌塑料容器上，并放入25℃的恒温箱中培养，每间隔12 h直至156 h用Biolog自动读数装置在590 nm下读数。计算单孔平均颜色变化率(AWCD)来反映微生物代谢功能多样性。

1.5 数据分析

土壤微生物群落功能多样性：观察比较微生物群落平均颜色变化率(AWCD)随时间的变化曲线，根据不同处理对碳源的利用情况，综合考虑变化趋势，选取光密度趋于稳定且不同处理之间有较好分形的96 h的AWCD值进行土壤团聚体微生物群落代谢多样性分析，选择处于AWCD曲线“拐点”处或其后的数据，此时微平板的培养时间可以最大限度满足各类细菌的生长，从而在一定程度上可以更准确地反映不同环境微生物群落的差异性，并计算Shannon丰富度指数(H)，McIntosh均一性指数(U)，Simpson优势度指数(D)。具体计算公式如下:

式中，Ci为第i孔的相对吸光值，C是每个孔(光密度测量)的吸光度，R为板内控制孔的吸光度，n为底物的数量(ECO板，n=31)；Pi为第i孔的相对吸光值与整板的相对吸光值总和的比率。

试验数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，用Canoco 4.5进行主成分分析，使用Sigmaplot 12.0作图。

2 结果与分析

2.1 土壤团聚体组成分布

图1所示，弃耕地开垦减少了各土层微团聚体(<0.25 mm)数量，相应的增加了大团聚体(>0.25 mm)数量。随着开垦土壤>0.25 mm团聚体有所增加，比弃耕地增加了10.5%。就同一粒径的不同土层来看，土壤团聚体的分布存在一定差异性。随着土层加深 >5 mm团聚体比例在开垦前后均呈现出下降的趋势；对于1～0.25 mm团聚体比例，开垦前在10～20 cm土层中最高，且显著高于其它土层，开垦后在5～10 cm土层中比例最高，与20～40 cm和40～60 cm土层之间差异显著；0.25～0.053 mm团聚体比例在开垦前后均是在40～60 cm土层中最高，开垦前在10～20 cm土层中比例最低，与5～10 cm土层差异不显著，开垦后在5～10 cm土层中比例最低，与0～5 cm和10～20 cm差异不显著。土壤团聚体的组成分布及基本特征是土壤肥力的基础，是判断土壤质量状况的依据，而>0.25 mm大团聚体是土壤中最好的结构体，其含量越多，说明土壤团聚体的稳定性越好[22]。

综合来看，0～20 cm土壤团聚体组成在开垦前后变化较大。其中0～5 cm、5～10 cm和10～20 cm土层中0.25～0.053 mm团聚体比例较开垦前均有了明显降低，分别降低了13.6%，16.3%和6.4%。而对应土层中1～0.25 mm团聚体比例比开垦前分别提高了63.61%、67.63%和17.22%。

2.2 土壤团聚体微生物群落功能多样性

2.2.1 土壤团聚体微生物群落代谢平均颜色变化率 平均颜色变化率(AWCD)反映了土壤微生物的代谢活性，是土壤微生物群落利用单一碳源能力的一个重要指标[23]，在一定程度上反映了土壤中微生物种群的数量和结构特征。AWCD随时间变化呈现出延续的常规生长曲线，随着培养时间的延长，开垦后土壤团聚体微生物利用碳源的量呈现出逐渐增加的的趋势，培养起始的24 h内AWCD变化并

不明显，而培养24～96h AWCD快速增长，此时微生物活性正处于旺盛时期，最后增长较为缓慢，直至趋于稳定。这一系列变化表明，土壤团聚体微生物首先经过24 h的滞后期，逐渐适应Biolog微平板基质环境，其次进入对数增长期，对碳源的利用能力逐渐增强，然后进入快速增长期，微生物的代谢强度达到最大，最后生长减缓趋于稳定。

比较图2看出，弃耕地土壤团聚体微生物群落AWCD最低，开垦后土壤团聚体微生物群落AWCD显著高于弃耕地；弃耕地<0.053 mm团聚体微生物群落AWCD显著高于>0.25 mm各粒径团聚体而1～0.25 mm团聚体微生物群落AWCD均要显著低于各粒径团聚体；开垦后各粒径团聚体微生物群落AWCD关系为：2～1 mm>0.25～0.053 mm>1～0.25 mm>(<0.053 mm)>(>5 mm)>5～2 mm，且无显著性差异。

注：同一土层不同粒径的不同小写字母表示差异显著，同一粒径不同土层深度的不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。Note: Different subscript letters and superscript letters indicate significant difference among different soil aggregates in same soil depth and among different soil depth in same aggregates at P<0.05 level, respectively.图1 开垦前后土壤团聚体组成分布Fig.1 Aggregate size distribution before and after reclamation of abandoned salinized soil

图2 开垦前后土壤团聚体微生物群落平均颜色变化率Fig.2 Average well color development of soil aggregate-associated microorganism communities before andafter reclamation of abandoned salinized soil

2.2.2 土壤团聚体微生物群落代谢多样性指数 碳源代谢多样性指数分析可以较为准确地反映出微生物群落功能多样性的特征。对土壤微生物培养96 h的碳源利用进行多样性指数分析。表1可以看出，>0.25 mm团聚体开垦后相比于弃耕地增加了土壤团聚体微生物物种丰富度指数，但并不显著，而<0.25 mm团聚体却相反；开垦前后土壤团聚体微生物物种丰富度指数，除了开垦后土壤0.25～0.053 mm和<0.053 mm团聚体外，其余均随着团聚体粒径的减小呈现出升高的变化。开垦后土壤各粒径团聚体微生物均匀度指数均要显著高于弃耕地。各粒径团聚体中弃耕地土壤团聚体微生物优势度指数均要高于开垦后，其中在5～2 mm、2～1 mm、1～0.25 mm和0.25～0.053 mm四个粒径中更为显著。

2.2.3 土壤团聚体微生物对六大碳源的利用强度 Biolog微平板中31种碳源根据其官能团的不同可以分为六大类，包括碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺类、酚类和羧酸。

图3可以看出，开垦后土壤团聚体微生物对碳水化合物、氨基酸、酚类和羧酸四类碳源的利用率均要高于弃耕地。弃耕地土壤团聚体微生物对这六类碳源的利用率大小为多聚物>胺类>碳水化合物>氨基酸>羧酸>酚类；开垦后土壤团聚体微生物对这六类碳源的利用率大小为碳水化合物>氨基酸>多聚物>酚酸>羧酸>胺类。弃耕地各粒径团聚体微生物对不同碳源利用率的高低并没有表现出一致的规律性；开垦后土壤除了<0.053 mm团聚体外，其余各粒径团聚体微生物对碳水化合物的利用率均达到最大，除了>5 mm和1～0.25 mm团聚体外，其余各粒径团聚体微生物对胺类的利用率最小。

2.2.4 土壤团聚体微生物群落代谢功能主成分分析 土壤微生物多样性可以反映出群落总体的变化规律，但不能反映微生物群落代谢的详尽信息，通过土壤微生物对不同碳源利用能力的差异性进行分析，有利于更好地了解微生物群落代谢功能特性[24]。运用主成分分析在31种因子中提取的2个主成分因子，由图4可知，第一主成分可以解释所有变量方差的75.9%，第二主成分可以解释所有变量方差的7.3%，累计贡献率为83.2%。

表1 开垦前后土壤团聚体微生物群落多样性指数

图3 开垦前后土壤团聚体微生物对六大碳源的利用强度Fig.3 Carbon source utilization of soil aggregate-associated microorganism before and after reclamation of abandoned salinized soil

弃耕地各样方在PC1和PC2上分布集中，说明不同粒径团聚体微生物碳源利用差异较小；开垦后各样方在PC1和PC2上分布较分散，说明不同粒径团聚体微生物碳源利用差异较大，PC1和PC2基本上能够区分不同粒径团聚体微生物的群落特征。弃耕地与开垦后土壤团聚体微生物在PC1上差异显著，弃耕地土壤团聚体微生物的得分为负而开垦后土壤团聚体微生物得分为正，说明土地开垦对土壤团聚体微生物群落有较大影响。通过聚类分析也可得知，土壤微生物群落分为两类，弃耕地各粒径团聚体微生物聚为一类，开垦后各粒径团聚体微生物聚为一类，说明开垦引起了土壤团聚体微生物对碳源利用的明显变化。

图4 开垦前后土壤团聚体微生物群落功能主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil aggregate-associatedmicroorganism communities function before and after reclamationof abandoned salinized soil

对31种碳源主成分分析中因子载荷可以反映出碳源利用的差异，其绝对值越大，表明该碳源对主成分的影响越大，在众多碳源中起主要分异作用。

由表2得知，与PC1具有较高相关性的碳源(|r|>0.6)有29种，其中碳水化合物类10种，氨基酸类5种，羧酸类7种，多聚物类4种，酚酸类2种，胺类1种；与PC2具有较高相关性的碳源有1种，包括氨基酸类1种。综合与PC1和PC2具有较高相关性的碳源类型发现，对土壤微生物群落代谢特征起分异作用的主要碳源为碳水化合物类、羧酸类和氨基酸类，即土地利用方式对土壤团聚体微生物群落代谢多样性的差异主要体现在对碳水化合物类、羧酸类和氨基酸类碳源的利用上，其中碳水化合物类碳源尤为突出。

表2 31种碳源的因子载荷值

3 讨 论

研究结果表明盐碱弃耕地在开垦后显著增加了土壤大团聚体(>0.25 mm)数量，减少了微团聚体(<0.25 mm)数量。>0.25 mm团聚体含量与弃耕地相比增加了10.5%。弃耕地开垦后，土壤有机碳得到增加[25]。土壤有机碳与土壤团聚体关系紧密，对土壤团聚体含量和组成分布具有重要影响[26]。土壤有机碳是土壤团聚体形成的重要胶结剂，土壤有机碳含量的增加有利于土壤结构的形成和稳定性的增强[9]。盐碱弃耕地开垦前后>0.25 mm团聚体含量明显增加，使耕层土壤结构得到了改善。这与弃耕地开垦后种植棉花并持续全量秸秆还田有关。秸秆还田不仅可以改善土壤的养分状况，还可以通过增加土壤有机碳的直接输入实现固碳。秸秆还田还可以分解产生多种有机物质，如蛋白质，多糖，木质素等，同时还能够提高土壤微生物活性，促进腐殖质的形成，这些都是土壤中重要的胶结物质，对大团聚体的形成产生积极影响[27]。本研究表明，在0～20 cm土层0.25～0.053 mm微团聚体含量较开垦前降低，其变化与大团聚体变化相反，说明大团聚体和微团聚体之间存在着转化，秸秆还田利于微团聚体在植物根系和菌丝体的作用下形成大团聚体[28]。

温度、水分等环境因素也是促进大团聚体形成的要素。陈强[29]发现，夏季8月温度及湿度状况最佳，秸秆分解速率大，为土壤大团聚体形成提供胶结物质，利于大团聚体形成。Vermang[30]得出水稳性团聚体随着含水量的增加而增加，但也有研究表明增加含水量会降低团聚体抗张强度和土壤黏聚力[31]。土壤温度以及水分等变化同样可以起到增加大团聚体的作用。干旱区大面积盐渍化弃耕地，盐碱重、养分瘠薄，经人为开垦种植棉花并长期秸秆还田后，有利于土壤表层大团聚体的形成与稳定。

开垦后土壤团聚体AWCD显著高于弃耕地，说明开垦后土壤团聚体微生物群落活性以及碳源利用能力均较强。研究发现，土壤结构和土壤有机质对土壤微生物活性产生影响[32]。土壤有机碳与土壤微生物功能多样性关系密切[33]。开垦后种植棉花引入了植被，植被通过影响土壤含水量、温度、透气性、pH以及土壤有机碳、氮水平从而影响土壤微生物群落多样性[34]。土壤微生物的生活需要从植被获取营养物质和能量，同时植被根系又可以为土壤微生物提供良好的生活环境。植被的存在有利于增加土壤微生物多样性和微生物生物量[34]。然而土壤微生物的生长还受水分条件的制约，弃耕地较开垦后棉田没有灌溉水作为水分的来源，地处于半干旱地区，所以干旱可能是影响土壤微生物群落活性和多样性的胁迫因子。干旱降低了底物的扩散增加了微生物对碳、氮的需求[35]。开垦后化肥的施用不但直接影响了土壤化学性质，致使土壤微生物活性改变从而影响了土壤微生物群落结构的变化，还影响了地上植被的生长，间接影响了土壤微生物群落结构。

4 结 论

弃耕地开垦增加了土壤大团聚体数量，增加了10.5%，减少了微团聚体数量。其中0～5 cm、5～10 cm和10～20 cm土层中1～0.25 mm团聚体含量较开垦前分别提高了63.61%、67.63%和17.22%。开垦后土壤团聚体微生物利用碳源的量显著增加，增加了>0.25 mm团聚体土壤微生物物种丰富度指数，显著增加了各粒径土壤团聚体微生物均匀度指数，同时降低了各粒径土壤团聚体微生物优势度指数。开垦前后土壤团聚体微生物对6大碳源利用强度存在着差异，其优势碳源发生了转变由多聚物类转变为碳水化合物类。开垦引起了土壤团聚体微生物对碳源利用的分异，其差异主要体现在碳水化合物、羧酸和氨基酸类碳源的利用，其中碳水化合物类尤为突出。