微波处理对豌豆种子萌发及芽苗中营养成分的影响

王顺民,卞紫秀,汪建飞,马文雅

(安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

谷物、豆类种子发芽后，其营养成分及矿物质含量增加，尤其限制性氨基酸含量增加，故使其消化率和生物利用率显著提高。同时发芽种子及芽苗中游离氨基酸、黄酮和酚类物质等功能活性成分的含量也显著提高[1]，从而使其具有独特的营养价值[2]。研究表明，磁场、电场等物理因素处理均会对生物组织表现出一定的生物效应[3]，从而对萌发胚芽生长有调控作用[4, 5]。微波属于一种电磁波，一定功率的微波能有效激活植物种子萌发期的超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢(Catalase，CAT)等酶类的活性，促进种子萌发及诱导种子中一些生物活性成分的合成。微波预处理可使植物幼苗叶片POD、SOD等同工酶的基因表达发生变异而起促进作用[5]，这种作用可显著增加种子的发芽势、发芽率、茎长、根长和总物质的量，并且其与微波功率的大小相关[6, 7]。植物种子经微波处理后，其相对幼苗活力指数可提高达18.67%[8]。大豆经微波处理8 s，其发芽率、发芽势和发芽指数显著提高，芽苗中蔗糖含量明显增加[9]。白兰瓜种子经低功率微波处理后，其萌发期的淀粉酶被激活，种子萌发活力提高[10]。苜蓿种子经800 W微波处理，其首日发芽率和种子内固氮菌的固氮酶活性分别比对照高出122%和104.9%[11]。低功率 (30%)预处理的冬小麦，萌发后幼苗叶片中POD和SOD同工酶的活性提高，种子萌发被促进。而高功率 (50%～80%)处理则起抑制作用，且随功率及时间的增加而抑制作用增强，且80%功率处理50 s，种子萌发能力完全丧失[12]。而盐胁迫过的小麦幼苗经微波处理后，其叶中丙二醛 (Malonaldehyde，MDA)含量和氧化型谷胱甘肽 (Oxidative glutathione，GSSG)等抗氧化酶酶活性均可恢复到接近于未经盐胁迫处理时[5, 13]。说明适当剂量的微波处理能够提高种子幼苗的萌发和增强耐盐等不良环境的能力。豌豆(PisumsativumL.)是世界第四大豆类作物，而我国是世界第二大豌豆生产国。促进豌豆种子的萌发，尤其是营养成分富集的方法有盐胁迫法和60Co-γ射线、秋水仙素及甲基磺酸乙酯等诱变处理法，但这些方法均不同程度的存在安全危害。因此，研究微波对豌豆萌发，探研微波的生物非热效应对植物种子体内生理生化的影响，将其有利的影响利用在作物栽培或植物育种上具有实用价值。用微波调控植物的生长发育，提高其酶活性、增加芽苗中营养成分的含量，将有着重要的生物学意义。因此，本文以白豌豆种子为原料，采用不同微波功率和时间处理萌发后的豌豆种子，研究微波处理对豌豆种子的发芽率和芽长及芽苗生长中还原糖、总黄酮等成分的影响。

1 材料与方法

1.1 试验原料、器材

1.1.1 试验原料及药品 实验原料：新疆白豌豆(PisumsativumL.)。江西南昌进贤县绿色芽苗菜有限公司提供。

1.1.2 试验器材 紫外可见分光光度计，UV-5800PC型，上海元析仪器有限公司；恒温培养箱，PYX-DHs·350-Bs，上海博泰实验设备有限公司；电子天平，JY1002，上海良平仪器仪表有限公司；微波设备，JHFWB-1.0S型，南京金海丰微波科技有限公司；冷冻离心机，TGL-16A，长沙平凡仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 预处理 选择颗粒饱满的种子，以去离子水冲洗干净。种子经1%次氯酸钠溶液消毒3～5 min。后用无菌水反复冲洗。以无菌滤纸吸干。

1.2.2 试验方法 微波处理：取经消毒后的种子分成若干组(每组50粒)，均匀铺置于15 cm的玻璃皿中，后置入微波设备中，采用6种不同的微波功率与时间组合(100W10s，200W10s，300W10s，100W30s，200W30s，300W30s)[9]进行微波处理。微波腔内温度控制为室温25℃±2℃。

1.3 实验测定指标与方法

1.3.1 发芽率、最终发芽率 发芽种子：种子胚根突破种皮，长度达种子长度1/2时，即为发芽种子。发芽率(Germination Rate, GR)：豌豆种子在1 d内的全部正常发芽种子粒数/供测豆子总数×100%。最终发芽率(Final Germination Rate, FGR)：豌豆种子在7 d内的全部正常发芽种子粒数/供测豆子总数×100%。

1.3.2 芽长 豌豆种子在30℃下浸种2 h，后30℃培养，分别随机取出培养7 d的不同微波处理的豌豆芽30粒，用游标卡尺测定其平均芽长。

1.3.3 总黄酮和还原糖含量 不同微波处理的芽苗，在80℃，干燥2 h，至含水量达10%。后粉碎、过筛 (80目)，备用。总黄酮含量测定，采用铝盐法[14]。还原糖含量的测定，参考赵凯等方法[15]。

1.3.4 蛋白质含量 样品预处理：分别取发芽3 d、5 d和7 d的不同微波处理的豌豆芽苗，用吸水纸吸干表面水分后，称重3 g，充分研磨 (加蒸馏水)，后转移到离心管中，然后在4 000 r·min-1的离心机中离心20 min，将上清液定容至50 mL。参照高俊凤主编《植物生理学实验指导》方法测定[16]。

1.3.5 过氧化氢酶活性 样品预处理：分别取发芽3 d、5 d和7 d的不同微波处理的豌豆芽苗，用吸水纸吸干表面水分，称重3 g，然后放进研钵中加入3 mL pH值7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在冰浴上研磨成匀浆，再加入5 mL磷酸缓冲液研磨均匀，转入25 mL的比色管中，并用缓冲溶液少量多次洗涤研钵，洗液并入比色管中，最后用缓冲液定容至刻度。摇匀后取约5 mL溶液于离心管中，采用冷冻离心机在4℃ 4 000 r·min-1下离心10 min，上清液即为过氧化氢酶提取液，转入试管中保存于4℃的冰箱中备用。参照高俊凤主编《植物生理学实验指导》方法测定[16]。

1.4 实验数据统计与方法

试验数据为3次重复，以平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0统计分析软件对其进行One-way方差分析(ANOVA)；并用Duncan's复相关试验法进行均值差异性的相关分析，显著性水平P≤0.05。

2 结果与分析

2.1 微波处理对发芽率的影响

由图1可知，培养1 d，微波100W10s处理的豌豆发芽率最高，达100%，比未经微波处理的增加10.0%，而300W30s处理的发芽率最低，仅为71.33%，比未经微波处理的低19.67%(P<0.05)。发芽7 d后，300W30s处理豌豆种子的最终发芽率最低，仅为 73.67%，比对照低21.67%。随微波处理功率的增加，发芽率显著降低 (P<0.05)。微波时间由10 s增加至30 s时，发芽率显著降低(P<0.05)。

注：图中小写字母为相同时间下不同功率处理间(CK、100，200，300 W)显著性检验(P<0.05)。Note: Different lowercase letters in the figure are significantdifferences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.图1 不同微波处理下豌豆种子发芽率和最终发芽率的变化Fig.1 Change of germination rate and final germination rate of pea seeds in different microwave treatment

2.2 微波处理对芽长的影响

从图2可知，微波显著影响了豌豆的芽长。微波处理10 s的种子，培育7 d时，芽长随微波功率的增加而先升高后降低，而经30 s处理者，其芽长随微波功率增加而降低。200W10s微波处理的芽长比对照高12.31%，而300W30s处理的芽长比对照低37.70%(P<0.05)。

2.3 微波处理对芽苗蛋白质含量的影响

经微波处理后，发芽3 d (图3A)时，豌豆芽苗蛋白质的含量均高于对照组，其中300W30s处理达15.47 mg·100mg-1，比对照高21.11%。但发芽5 d (图3B)时，蛋白质含量要低于对照。在相同时间下，功率由100 W增至300 W，其蛋白质的含量逐渐降低。发芽7 d (图3C)时，微波300W30s下蛋白质含量最低，为10.88 mg·100mg-1(P<0.05)。微波处理显著影响豌豆萌发后的芽苗中蛋白质的含量。

注：图中小写字母为相同时间下不同功率处理间(CK、100，200，300 W)显著性检验(P<0.05)。Note: Different lowercase letters in the figure are significantdifferences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.图2 不同微波处理豌豆芽长的变化Fig.2 Change of shoot length of pea sprouts in differentmicrowave treatment

注：图(A)、(B)和(C)分别为发芽3 d、5 d和7 d时的数据。图中小写字母为相同时间下不同功率处理间(CK、100，200，300 W)显著性检验(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.图3 不同微波处理下豌豆芽苗的蛋白质含量的变化Fig.3 Change of protein content of pea sprouts in different microwave treatment

2.4 微波处理对芽苗CAT的影响

发芽3 d (图4A)，不同微波处理对芽苗CAT的活性影响显著(P<0.05)。300W30s处理下活性最高为1.23 mgH2O2·g-1FW·min-1，而100W30s处理的活性最低为0.39 mgH2O2·g-1FW·min-1。处理10s时，CAT活性随微波功率的增加趋势变化不大。发芽5 d (图4B)时，微波的芽苗中，200W10s处理下的CAT活性最大为0.66 mgH2O2·g-1FW·min-1。当时间为10 s和30 s时，CAT活性随着微波功率的增加均呈先增加后降低趋势。发芽7 d (图4C)时，对照组的CAT的活性与微波处理的各组间差异显著(P<0.05)。其中以300W30s的活性最高为0.88 mgH2O2·g-1FW·min-1，而300W10s处理者的活性值最低，为0.42 mgH2O2·g-1FW·min-1。可能因为高剂量长时间微波处理对种子的影响较大，种子为适应胁迫环境而激活了更多过氧化氢酶。

2.5 微波处理对芽苗还原糖含量的影响

发芽3 d (图5A)时，微波处理豌豆的芽苗中还原糖的含量均高于对照组。300W10s处理的芽苗中还原糖含量最高，达10.11 mg·100mg-1。发芽5 d (图5B)时，200W10s处理的芽苗中还原糖含量为5.17 mg·100mg-1，高于300W10s处理组。芽苗中还原糖含量随微波功率的增加先升高后减低。发芽7 d (图5C)时，100W30s处理后的种子的芽苗中还原糖含量最高，为4.56 mg·100mg-1，而300W30s处理者的含量最低，为1.47 mg·100mg-1。芽苗中还原糖含量随微波功率的增加先增加后降低(P<0.05)，随发芽时间增加逐渐降低。微波处理显著影响豌豆芽苗中的还原糖含量，且发芽3 d到5 d时的还原糖含量变化较大。这种现象是由于还原糖在种子发芽的过程中只是一种过渡形式，在发芽的过程中会逐渐被胚所吸收，所以其整体呈逐渐降低趋势。

2.6 微波处理对芽苗总黄酮含量的影响

从图6A可知，发芽3 d时，处理10 s的豌豆种子，其芽苗的总黄酮含量随微波功率的增加呈先升高后降低，100W10s处理时最大，而300W10s处理最低。处理30 s时，微波功率对豌豆芽苗中总黄酮的影响趋势与之相同。200W30s处理下总黄酮含量为最高，达1.48 mg·100mg-1，而300W10s处理的含量最低，为0.96 mg·100mg-1。发芽5 d (图6B)时，微波处理的芽苗的总黄酮含量低于对照组，其中300W10s的含量最低为0.93 mg·100mg-1。豌豆芽苗中的总黄酮含量随微波功率的增加而逐渐减少。处理10 s与30 s间变化趋势相同。发芽7 d (图6C)时，微波处理过的芽苗中总黄酮含量显著低于对照组，且其含量随微波功率的增加而逐渐降低。

注：图(A)、(B)和(C)分别为发芽3 d、5 d和7 d时的数据。图中小写字母为相同时间下不同功率处理间(CK、100，200，300 W)显著性检验(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.图4 不同微波处理的豌豆芽苗的CAT活性的变化Fig.4 Change of CAT activity of pea sprouts in differentmicrowave treatment

注：图(A)、(B)和(C)分别为发芽3 d、5 d和7 d时的数据。图中小写字母为相同时间下不同功率处理间(CK、100，200，300 W)显著性检验(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.图5 不同微波处理下豌豆芽苗中还原糖含量的变化Fig.5 Change of reducing sugar of pea sprouts in different microwave treatment

注：图(A)、(B)和(C)分别为发芽3 d、5 d和7 d时的数据。图中小写字母为相同时间下不同功率处理间(CK、100，200，300 W)显著性检验(P<0.05)。Note: Figures (A), (B) and (C) are data for 3 d, 5 d and 7 d of seedling, respectively. Different lowercase letters in the figure are significant differences (P<0.05) between different power treatment (CK, 100, 200 and 300 W) at the same time.图6 不同微波处理的豌豆芽苗的总黄酮含量的变化Fig.6 Change offavonoids content of pea sprouts in different microwave treatment

3 讨 论

低功率短时间微波处理有利于豌豆种子的萌发，而高功率长时间则会抑制种子的萌发，降低发芽率、芽长，尤其是高功率长时间处理(图2)。在同一时间下，发芽率和最终发芽率及芽长均随微波功率增加而降低(图1和图2)。本研究结果与微波处理冬小麦的研究结果一致[12]。高功率长时间微波处理会显著影响种子中酶的空间结构，甚至起钝化作用[17]。本研究中，微波处理后，芽苗中CAT活性随微波功率增大和时间延长而增加(图4)。植物在逆境胁迫下，通过调节基因的表达，细胞产生快速感应，进而使相关酶的活性发生变化，同时，黄酮类化合物和脯氨酸(Pro)等渗透调节物质含量增加，以此适应胁迫环境。本研究中豌豆芽苗中蛋白质的含量随微波功率的增加而降低(P<0.05)。发芽3～7d内，相同功率和时间下，芽苗中蛋白质含量随发芽时间的增加而降低(图3)。微波处理有利于豌豆芽苗生长前期组织内蛋白质的富集。但是在生长后期，各微波处理组中蛋白质含量均降低且与功率增加和时间延长呈相反趋势。可能因为微波处理对种子形成了特殊的环境胁迫，导致种子需要消耗更多的蛋白质去适应生长环境[18]。不同处理时间(10 s和30 s)，豌豆苗中还原糖含量均随微波功率的增加先增加后降低(图5)。磁场等逆境胁迫可诱导苦荞种子中PAL、CHI和FLS基因的表达，使萌发后的芽苗中总黄酮含量显著增加[14]。在本研究中，微波处理的芽苗中总黄酮含量呈先增加后降低，发芽前期微波处理有利于总黄酮含量的增加。微波功率和处理时间均显著影响豌豆芽苗中总黄酮的含量(图6)。这说明微波处理不仅影响豌豆种子萌发，还对幼苗生长、生化代谢及生物量的积累产生影响。

4 结 论

微波低功率短时间处理有利于豌豆种子的萌发，但大功率较长时间会造成发芽率降低。在相同的微波功率下，发芽率和最终发芽率受处理时间的影响较低。微波短时处理促进种子的生长发育，芽长较长，而长时间处理则抑制生长。微波处理有利于豌豆芽苗中CAT活性增加和还原糖含量的积累，显著影响芽中蛋白质和总黄酮的含量，且微波处理有利于芽苗生长前期组织内蛋白质和总黄酮含量的富集。即微波处理不仅影响了种子萌发，还对幼苗生长、生化代谢及化学成分的积累产生影响。