外源油菜素内酯对玉米幼苗镉毒害耐受性的影响

王 芳，彭云玲，方永丰，慕 平，王 威，张文姣

(甘肃农业大学农学院/甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070)

镉(Cadmium，Cd)是生物毒性很强的重金属，被称为“五毒之首”，在自然界中常与锌、铜、铅并存，主要通过对水源的直接污染，以及通过食物链的富集作用对人类健康造成危害。随着工业化和城市化的发展，农田土壤和水体重金属镉累积超标问题日益严重，含镉的污染物通过各种途径进入土壤，使农作物产量和质量下降，从而危害人类的健康，并导致大气和水环境质量的进一步恶化[1]。利用外源物质对植物进行处理，是目前提高植物抗逆性简便、可行的方法之一。油菜素内酯是第一个被分离出的具有活性的油菜素甾族化合物(Brassinosteroids，BRs)，是国际上公认的活性最高、最广谱的一类植物生长激素，可以激发植物内在潜能，促进作物生长，改善高温、重金属、干旱、低氧等不良环境下植物的抗氧化性能，减少其膜脂过氧化程度，从而促进植物的光合作用及干物质积累，使作物耐逆性增强，增加作物产量[2]。马梅等[3]研究表明，外源油菜素内酯可以改善盐胁迫下油菜幼苗的渗透调节和离子稳态，促进其在盐胁迫下的光合作用和生物量积累。宋吉轩等[4]研究表明油菜素内酯能有效减缓干旱胁迫对羊草造成的伤害，提高羊草株高、叶面积和光合色素含量，促进干物质积累，降低膜脂过氧化产物MDA与质膜透性，提高脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等渗透调节物质含量，增强抗氧化酶活性。外源油菜素内酯可减轻NaCl胁迫下棉花叶片受抑制程度，从而使NaCl胁迫下棉花叶片生理功能增强，生物量增加[5]。外源 EBR 处理可调节辣椒根系形态和提高根系抗氧化酶活性，增强植株抗低温胁迫的能力[6]。然而，有关油菜素内酯在提高植物抗重金属方面的研究却鲜有报道。玉米(ZeamaysL.)是我国最重要的粮食作物之一，适应性强、产量高，是重要的粮食、饲料、工业原料作物。为此，本试验以玉米为材料，研究了外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗生理机制的影响，探讨油菜素内酯缓解镉胁迫的生理机理，以明确油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗的保护机制，为探明油菜素内酯减轻植物镉毒害的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验玉米品种为“郑单958”玉米种子。

1.2 试验方法

1.2.1 试材培育 挑选饱满均一的玉米种子，用0.1%的次氯酸钠消毒10 min后，漂洗干净，在25℃下，以蒸馏水浸种12 h后播种到垫有两层滤纸的直径为15 cm的培养皿中，置于25℃培养箱中，玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到塑料花盆中，每盆植苗8株，于人工气候室内常规培养，每2 d用1/5浓度的Hoaglands营养液浇灌，待第4片叶长出后，选取长势良好和长势一致的玉米幼苗进行镉胁迫试验。

1.2.2 试验处理 配置油菜素内酯水溶液0.1%的母液，4℃下保存，用时按所需浓度稀释。试验首先根据前期试验研究的结果，选取100 mg·L-1Cd2+作为胁迫条件[7]，油菜素内酯溶液的浓度设定0，0.004%，0.008%，0.012%，0.016% 6个浓度处理：

CK对照，Hoagland溶液；

T1：含100 mg·L-1Cd2+的Hoagland溶液；

T2：含100 mg·L-1Cd2+和0.004%油菜素内酯的Hoagland溶液；

T3：含100 mg·L-1Cd2+和0.008%的油菜素内酯Hoagland溶液；

T4：含100 mg·L-1Cd2+和0.012%的油菜素内酯Hoagland溶液；

T5：含100 mg·L-1Cd2+和0.016%的油菜素内酯Hoagland溶液。

处理7 d后取玉米幼苗第二片功能叶进行各项生理指标的测定，每个指标测定3次，求平均值。

1.3 试验方法

1.3.1 生长量的测定 每处理随机挑选10株幼苗，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3次，用吸水纸吸干植株表面的残留水分，依次用直尺测定其根长、株高。将上述取样植株分成地上、地下两部分，先称鲜重，然后置于烘箱内，105℃下杀青30 min，80℃恒温烘干称重，并计算单株苗鲜/干重，3次重复。

1.3.2 生理指标的测定 SOD活性的测定采用NBT光化还原法[8]，用分光光度计测定560 nm处的吸光值，以NBT光化还原被抑制50%的酶液量为1个酶活单位。POD活性的测定采用愈创木酚法[8]，在470 nm处以30 s为间隔作2 min的时间扫描，以1 min内OD470值变化的0.01为1个酶活力单位。CAT活性的测定采用紫外分光光度法[8]，以1 min内OD240值变化的0.1为1个酶活性单位。丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[9]。游离脯氨酸含量的测定采用茚三酮显色法[9]；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法[9]；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[9]；叶绿素含量的测定采用丙酮乙醇混合液提取法[10]；叶片含水量的测定采用蒸馏水浸泡法[10]；电导率的测定采用双蒸水煮沸法[10]；根系活力的测定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[10]。

1.4 数据处理

数据采用 Microsoft Excel 2003进行绘图，用SPSS 16.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗生长的影响

由表1可以看出，与对照相比，镉胁迫(T1)处理下玉米幼苗生物量显著下降，添加不同浓度的油菜素内酯后， T2，T3，T4，T5处理均较T1显著增加，表明油菜素内酯可以缓解镉毒害对玉米幼苗生长的影响，其中，T4处理的缓解效果最明显。

2.2 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影响

由图1A可知，在T1处理下玉米幼苗的POD活性显著下降，较对照降低了7.59%(叶)和10.2%(根)。与T1相比，添加不同浓度的油菜素内酯后，T2、T3、T4、T5各处理玉米幼苗的POD活性明显上升，分别上升了0.33%、1.79%、4.21%、1.84%(叶)和5.4%、8.8%、5.0%、0.1%(根)。由图1B可知，在T1处理下，玉米幼苗中SOD含量显著下降，与对照相比，下降了46.16%(叶)和3.2%(根)。T2、T3、T4、T5处理与T1相比SOD含量均有所增加，分别增加了15.66%、18.64%、67.2%、34.36%(叶)和2.3%、3.2%、0.5%、0.9%(根)。由图1C可知，在T1处理下玉米幼苗CAT活性显著降低，较对照下降了14.61%(叶)和18.5%(根)，T2、T3、T4、T5处理与T1相比，CAT活性均有所增加，分别增加了3.27%、5.00%、13.98%、5.57%(叶)和13.9%、14.6%、7.5%、9.4%(根)。就同一处理条件下，其叶片的CAT活性低于根的，POD和SOD活性高于根的，但其总体变化趋势是一致的。

表1外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗生长的影响

Table 1 Effect of exogenous brassinosteroid on maize seedling growth under Cd stress

处理Treatment地上鲜重/(g·plant-1)Shoot fresh weight地上干重/(g·plant-1)Shoot dry weight地下鲜重/(g·plant-1)Root fresh weight地下干重/(g·plant-1)Root dry weight根长/cmRoot length株高/cmHeightCK2.35783a0.15257a1.43237b0.11950a21.02a30.37bT11.62763c0.11863b1.25870c0.10890b17.32f28.85cT21.90549b0.13510b1.34080c0.11917a19.43e31.35bT32.18577b0.14967a1.35327c0.12250a19.70d31.84aT42.59070a0.18243a1.70510a0.13897a20.31b32.15aT52.58231a0.18137a1.44510b0.11520b20.01c32.07a

注：不同小写字母代表不同处理间在0.05水平差异显著，下同。

Note：Different small letters show a significant difference at the 0.05 level among the treatments. The same as below.

注：不同小写字母代表不同处理间在0. 05水平差异显著，下同Note：Different small letters show a significant difference at the 0.05 level among the treatments, the same below.图1 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性的影响Fig.1 Effect of exogenous brassinosteroid on the POD、SOD、 CAT activity of maize seedling under Cd stress

2.3 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗MDA含量和质膜透性的影响

由图2A可知，在单独镉胁迫T1处理下玉米幼苗MDA含量显著上升，与对照相比上升了38.56%(叶)和73.2%(根)，而在添加了不同浓度的油菜素内酯的T2、T3、T4、T5处理下，MDA含量相对于T1均有所下降，分别降低了13.31%、24.72%、30.01%、0.83%(叶)和28.6%、22.0%、32.6%、27.3%(根)。由图2B可以看出，与对照相比，T1处理后玉米幼苗质膜透性显著增加，增加了73.83%(叶)和55.8%(根)。T2、T3、T4、T5与T1相比，玉米幼苗的质膜透性均下降，分别下降了4.16%、7.60%、39.38%、32.86%(叶)和11.7%、18.7%、29.0%、21.0%(根)。就同一处理条件下，其叶片的MDA含量低于根的，质膜透性高于根的，但其总体变化趋势是一致的。

2.4 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响

由图3A可以看出，与对照相比，在T1处理下玉米幼苗中可溶性糖含量显著降低，降低了62.94%(叶)和34.9%(根)。在T2、T3、T4、T5处理下，玉米幼苗中可溶性糖含量相对于T1均增加，分别增加了8.33%、13.62%、53.15%、0.35%(叶)和15.5%、20.2%、35.5%、7.9%(根)。

图2 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗MDA含量和质膜透性的影响Fig.2 Effect of exogenous brassinosteroid on the MDA content and membrane permeability of maize seedling under Cd stress

图3 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响Fig.3 Effect of exogenous brassinosteroid on the soluble sugar, soluble protein and proline content of maize seedling under Cd stress

由图3B可知，T1处理下玉米幼苗可溶性蛋白含量较对照显著降低，降低了49.78%(叶)和46.9%(根)。T2、T3、T4、T5处理与T1相比可溶性蛋白含量均上升，分别上升了14.21%、61.35%、98.34%、58.64%(叶)和27.9%、33.2%、57.5%、39.5%(根)。其中，T4处理的玉米幼苗可溶性蛋白含量上升最为明显。由3C可知，在T1处理下玉米幼苗中脯氨酸含量显著下降，相对于对照下降了62.69%(叶)和50.8%(根)。T2、T3、T4、T5处理下玉米幼苗中脯氨酸含量与T1相比均上升，分别上升了18.51%、27.19%、79.28%、26.22%(叶)和12.9%、55.3%、25.9%、0.6%(根)。就同一处理条件下，其叶片的可溶性蛋白和可溶性糖含量低于根的，脯氨酸含量高于根的，但其总体变化趋势是一致的。

2.5 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗叶片叶绿素的影响

从图4看出，与对照相比，T1处理下玉米幼苗叶片叶绿素含量显著下降，下降了74.24%。T2、T3、T4、T5处理与T1相比，玉米幼苗叶绿素含量均上升，分别增加了36.54%、56.38%、90.08%、1.87%。可见，T4处理下叶绿素含量最高。

图4 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗叶片叶绿素含量的影响Fig.4 Effect of exogenous brassinosteroid on chlorophyll contentin leaves of maize seedling under Cd stress

2.6 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗叶片相对含水量的影响

从图5中可以看出，与对照相比，T1处理后玉米幼苗叶片含水量显著降低，下降了6.40%。说明当玉米幼苗受镉胁迫时细胞组织遭到破坏。T2、T3、T4、T5与T1相比，玉米幼苗的相对含水量均有所上升，分别上升了1.59%、2.71%、4.87%、1.79%。可见，镉胁迫下，T4处理下玉米幼苗细胞损坏程度最小，与其它处理也有显著性差异。

2.7 油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗根系活力的影响

由图6可见，T1处理与对照相比，玉米幼苗根系活力显著降低，降低了48.38%，T2、T3、T4、T5处理与T1处理相比，玉米幼苗根系活力明显上升，分别上升了23.65%、30.10%、41.08%、23.65%。T4处理下玉米幼苗根系活力上升幅度最大。

图5 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗叶片相对含水量的影响Fig.5 Effect of exogenous brassinosteroid on leaf water contentin leaves of maize seedling under Cd stress

图6 外源油菜素内酯对镉胁迫下玉米幼苗根系活力的影响Fig.6 Effect of exogenous brassinosteroid on root activityof maize seedling under Cd stress

3 讨 论

环境污染中最突出的是重金属污染，近年来，随着采矿、废气排放、污水灌溉和使用重金属超标制品等人类活动导致环境中的重金属含量增加，超出正常范围，直接危害人体健康，并导致环境恶化[11]。通常植物在受到重金属污染时都会出现生长迟缓、植株矮小、根系伸长受抑制直至停止、叶片褪绿、出现褐斑等症状，严重时甚至导致作物产量降低和植物死亡。镉是广泛存在于自然界中的毒性最强的重金属之一，为植物的非必需元素，进入植物体并积累到一定含量后会破坏生物细胞的结构功能[12]，镉对植物的危害首先体现在种子的萌发与幼苗的生长上。油菜素内酯作为一种植物激素在提高作物抗逆性方面起重要作用[13]，本试验通过用不同浓度油菜素内酯对重金属镉胁迫下玉米幼苗生理特性进行研究，结果表明，一定浓度的油菜素内酯(0.012%)可以显著提高玉米幼苗植株的抗性，促进玉米幼苗生长和正常生理机能的进行。这与Hasan等[14]研究外源表油菜素内酯(EBL)改善Cd胁迫下番茄幼苗的生长状况一致。Sharma[15]等研究也证实EBL缓解重金属胁迫下芥菜的生长及生物量。

正常生理状态下，由于植物体内抗氧化系统的清除作用，植物体产生的自由基和清除自由基的速率处于动态平衡状态。但当植物受到逆境胁迫时，体内自由基产生增多，活性氧含量会增加，破坏了他们之间的动态平衡，对机体的蛋白质、脂质和DNA造成损伤。SOD、CAT、POD是机体抗氧化系统中重要的抗氧化酶，能通过有效清除氧自由基来减轻脂质过氧化对机体造成的损伤[16]。Rady[17]等研究表明，EBL处理的菜豆在镉胁迫下可保持较高的抗氧化酶活性，吴雪霞[16]等研究也报导适宜浓度EBL能够提高高温胁迫下茄子幼苗抗氧化酶活性，从而提高植物耐受性。本试验结果表明，镉胁迫下玉米幼苗SOD、CAT、POD活性相对于对照组都有大幅度的下降，加入一定浓度的油菜素内酯后有不同程度的缓解作用。

脂质过氧化能够严重损伤植物的细胞膜系统，破坏叶绿体和线粒体的超微结构，导致叶绿体降解，光合酶等多种酶活性下降。MDA是细胞膜脂质过氧化的最终产物，MDA含量的高低显示了脂质过氧化作用的强弱程度。电导率是衡量植株细胞内容物扩散的一项生理指标，也可作为细胞组织幼嫩程度和细胞质膜是否受到伤害的指标[18]。本试验结果表明，Cd胁迫下玉米叶片MDA含量和质膜透性显著增高，在0.012%浓度的油菜素内酯处理下MDA含量和质膜透性显著降低，说明油菜素内酯缓解了镉毒害下玉米幼苗细胞膜受伤害的程度。Hasan[14]的研究也曾报导EBL处理显著降低了番茄植株体内MDA含量，减轻了植物伤害。同样郭本森[19]等研究了表油菜素内酯对大麦抽穗后期叶的生理特性的影响，结果表明在大麦抽穗后期用EBR喷洒能使细胞膜透性明显降低，会在一定程度上抑制叶片膜质过氧化的发生，提高大麦的抗逆性。

渗透调节是植物在胁迫条件下主动增加细胞溶质含量，降低植株水势，保持细胞水势以抵抗逆境的一种方式[20]。可溶性糖能提供能源物质，维持蛋白质渗透压稳定，重金属离子进入植物后，能与其它化合物合成金属络合物或螯合物，抑制植物各种代谢活动尤其是蛋白质的合成。脯氨酸是干旱、高盐、高温、冰冻和重金属等逆境胁迫下植物体内积累的主要渗透物质[21]。本试验测定结果表明，镉处理下植物幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量较对照均下降，加入油菜素内酯后会有不同程度的上升。一定浓度的镉离子溶液可导致量下降，主要因为镉进入细胞后促进蛋白水解酶的活性，加强了原有蛋白质分解；同时镉对蛋白合成的众多酶系均有毒害和钝化作用，并且会使蛋白质合成的相关细胞器受到损伤，抑制新蛋白的合成。这与乔琳[22]等研究外源油菜素内酯对铅毒害玉米幼苗的结论相一致。

叶绿素是植物进行光合作用合成有机物的光合色素，其含量的多少反映了植物光合作用能力的大小。有研究表明，油菜素内酯能通过促进小麦等植物叶片的RuBP羧化酶的活性、提高叶绿素含量[23]。本试验结果表明镉毒害降低了玉米植株叶绿素的含量，使光合作用能力变小，适宜浓度的油菜素内酯可以显著提高镉胁迫下玉米幼苗叶片中叶绿素的含量，使光合作用正常进行，有效缓解镉对玉米幼苗的胁迫作用。沈秀瑛[24]用BR处理玉米叶片后叶绿素含量明显增加。翁晓燕[25]等研究表明抽穗后的水稻经油菜素内酯处理，其叶绿素含量及净光合速率都高于对照，这与本试验得出的结论一致。

4 结 论

在单纯镉胁迫处理下玉米幼苗的生长量(干重、鲜重、株高)、抗氧化酶(SAT/POD/SOD)活性、可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量、叶绿素含量、叶片含水量相对于对照都会降低，同时，植株的MDA含量和电导率会增加，这说明重金属镉会对玉米幼苗产生一定的毒害作用，使其酶活性降低，破坏细胞组织结构而影响其一系列的生理特性。而当加入油菜素内酯后会对酶活性以及其它生理特性有一定的缓解作用，其中以0.012% 浓度缓解效果最明显，这说明油菜素内酯对玉米幼苗镉毒害的耐受性有一定的缓解作用。