不同生物活性材料对间充质干细胞功能影响的比较

刘元媛,曹晓沧

（天津医科大学总医院消化内科，天津300052）

MSCs是一组多能异质性群体，在体外具有多向分化潜能，可分化为脂肪、骨、软骨等组织[1-4]。而且，间充质干细胞的来源十分广泛，主要来源于骨髓、脂肪、脐带以及胎盘等组织[5-8]。近几年，人胎盘来源的间充质干细胞由于其提取方便、成本小、易于培养、效果显著等诸多优点逐渐成为众多干细胞研究者的研究热点[9-14]。间充质干细胞的多能性除了多向分化潜能外还主要体现在免疫调节及抗炎作用。然而，免疫抑制及抗炎作用的发挥依赖于MSCs所分泌的细胞因子，其中主要为肿瘤坏死因子诱导蛋白-6（tumor necrosis factor-α-induced gene/protein 6 ，TSG-6）及前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）[15-17]。

近年来，为了提高MSCs的生物学效应，人们研制出多种生物活性材料以提高MSCs的活性及利用率。本课题组将壳聚糖（chitosan，CS）连接到人胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1）的C结构域或者连接到一氧化氮（nitric oxide，NO）合成CS-IGF-1C或者CS-NO水凝胶，其在体外与体内都具有促进MSCs生物学效应的功能[18-19]。然而，本实验重在进一步研究CS、CS-IGF-1C以及CS-NO水凝胶三者对于MSCs的不同影响，以利于日后研究有目的地选择与利用。

1 材料与方法

1.1 实验对象和主要试剂

1.1.1 实验材料 人胎盘来源的间充质干细胞（hP-MSCs）由北京干细胞库提供；CS、壳聚糖-胰岛素样生长因子-1C、壳聚糖-一氧化氮（CS-NO）水凝胶由南开大学分子生物研究所合成。

1.1.2 主要试剂 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，sigma）购买自上海易佰聚经贸有限公司；MTT试剂盒购买自上海翊圣生物科技有限公司；萤火虫荧光素酶的底物（D-luciferin）购买自美国Caliperls公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 质粒提取及慢病毒包装感染 50 μL感受态细胞冰浴融化后加入目的DNA，混匀后冰浴30 min，42℃水浴热激45 s，快速冰浴2 min，加入400 μL LB液体培养基，37℃，200 r/min摇床培养1 h使菌体复苏，3 000 r/min离心1 min，弃部分上清，重悬菌液，转移至含抗生素的LB固体培养基，37℃培养1 h至液体被吸收，将平板倒置培养12～16 h。挑取平板上的单克隆加入15 mL含抗生素的LB液体培养基，37℃，200 r/min摇床内过夜培养。提取质粒，检测质粒溶液浓度，-20℃冻存。Lipofectamine 2000试剂盒进行慢病毒包装，于-80℃冻存待用。预先将1×105hP-MSCs铺于六孔板一孔，待贴壁后，吸出原有的培养基，更换为含有病毒液的培养基（2 mL不含抗生素的培养液+3 μL polybrene溶液（8 μg/mL）+1 mL病毒液）。将六孔板于37℃，1 600 r/min离心1 h，孵箱培养3 h后，用新鲜培养液更换含有病毒的培养液，37℃细胞培养箱中培养48 h后，于倒置荧光显微镜下观察GFP阳性细胞的表达情况，用生物发光成像仪检测萤火虫荧光蛋白的表达情况。

1.2.2 流式细胞分析 将转染的细胞传代扩增后进行消化计数，取1×105个细胞以1 200 rpm/min，4℃离心3 min，弃上清，用PBS缓冲液洗脱离心3次，最后一次弃上清后，用500 μL PBS重悬，移入流式管中，用200目的筛网过滤成单个细胞到新的流式管中，插入冰上，上机，按照FL-H1通道检测GFP阳性细胞的百分比。

1.2.3 MTT实验检测 3种水凝胶对细胞的增殖效果 MTT实验可很好的反应细胞的增殖效果，因此，我们将3种水凝胶按照已报道的最适浓度200 μmol/L 涂布于 96孔板（3 μL/孔）并将孔板置于37℃温箱中孵育30 min[18，20]。而后细胞均按照2×103的细胞浓度铺盘（5孔/组）。分别于24、48、72 h后进行MTT实验并用酶标仪检测OD490值。

1.2.4 生物发光成像仪检测 3种水凝胶对hPMSCs的促增殖作用 由于hP-MSCsGFP-Fluc可稳定表达GFP/Fluc，因此可根据这个特性，利用生物发光成像仪检测hP-MSCsGFP-Fluc的增殖效果。将不同水凝胶分别涂布于24孔板（10 μL/孔），将孔板置于37℃温箱中孵育30 min后培养hP-MSCs，每孔细胞数为5×104（3孔/组）。于24、48、72 h分别进行生物发光成像仪检测，D-luciferin每孔加10 μL。

1.2.5 H2O2诱导hP-MSCsGFP-Fluc的抗凋亡 再次利用hP-MSCs稳定表达GFP/Fluc的特性，预先将3种水凝胶涂布于24孔板，再将5×105个hP-MSCs/孔铺于孔板中，然后将 H2O2按照 50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L 的浓度梯度加入孔板，于37℃细胞培养箱中培养24 h，按照上述方法，利用生物发光成像检测细胞的存活。

1.2.6 RT-PCR检测不同培养条件下hP-MSCs的表达情况 利用Real time PCR检测三种不同水凝胶处理的hP-MSCs的增殖、凋亡、炎症、血管新生等相关因子的表达。Trizol法提取结肠组织中总RNA，需要测定的基因的引物序列，IGF-1，上游：5′-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3′，下游：5′-GCCTCC TTAGATCACAGCTCC-3′（扩增片段长度：109 bp）；HGF，上游：5′-GCTATCGGGGTAAAGACCTACA-3′，下游：5′-CGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3′（扩增片段长度：116bp）；EGF，上游：5′-TGTCCACGCAA TGTGTCTGAA-3′，下游：5′-CATTATCGGGTGAGGA ACAACC-3′（扩增片段长度：131 bp）；BAX，上游：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′， 下 游 ：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′（扩增片段长度：155 bp）；BAD，上游：5′-CCCAGAGTTTGAGCCGAG TG-3′，下游：5′-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′（扩增片段长度：249 bp）；FAS，上游：5′-TCTGGTTCTTA CGTCTGTTGC-3′，下游：5′-CTGTGCAGTCCCTAGC TTTCC-3′（扩增片段长度：197 bp）。FASG，上游：5′-CTCCGAGAGTCTACCAGCCA-3′，下游：5′-TGGA CTTGCCTGTTAAATGGG-3′（扩增片段长度：121bp）；TSG-6，上游：5′-TTTCTCTTGCTATGGGAAGACAC-3′，下游：5′-GAGCTTGTAT TTGCCAGACCG-3′（扩增片段长度：126 bp）；PGE2，上游：5′-CGATGCTCATGCTCTTCGC-3′，下游：5′-GGGAGACTGCATAGATGACAGG-3′（扩增片段长度：126 bp）；VEGF,上游：5′-AGGGCAGAATCATCAC GAAGT-3′，下游：5′-AGGGTCTCGATTGGATGGC A-3′（扩增片段长度：136 bp）；PDGF，上游：5′-GACT CAGGCGGAATCCAACC-3′，下游：5′-CTTGGGCTGT GAATACTTCCATT-3′（扩 增 片 段 长 度 ：122 bp）；GAPDH,上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′（扩增片段长度：122 bp）

2 结果

2.1 转染后hP-MSCs的特性 在显微镜下观察到，转染后的hP-MSCs细胞呈现成纤维细胞样梭形形态，在倒置荧光显微镜下观察到90%的hP-MSCs细胞呈GFP阳性。流式细胞分析结果也验证了这一结果。生物发光成像仪检测的结果表明，细胞的荧光强度与细胞数量呈较好的线性关系（R2=0.998 1）（图1），因此，在后续实验中可用荧光强度直接反映细胞数量。

2.2 不同水凝胶对hP-MSCs的促增殖作用 为了研究三者对细胞增殖的影响，首先我们进行了MTT细胞增殖实验，结果表明，CS-IGF-1C水凝胶与CS-NO水凝胶均可显著促进细胞增殖。而CS对细胞的增殖并没有明显效果。生物发光成像技术也说明，随着时间的延长，CS-IGF-1C水凝胶组细胞信号最强，细胞增殖最快。与此同时，Real time PCR结果显示，CS-IGF-1C水凝胶可显著促进增殖相关基因IGF-1，HGF及EGF的表达。CS-NO水凝胶对细胞的增殖也具有一定的促进作用，由此，进一步验证了CS-IGF-1C与CS及CS-NO相比能更好地促进细胞的增殖（图2）

2.3 不同水凝胶抗细胞凋亡的作用 实验结果显示，CS、CS-NO、CS-IGF-IC水凝胶都具有抗细胞凋亡的能力，但是CS-IGF-1C水凝胶抗细胞凋亡的能力更加显著，CS-NO水凝胶抗细胞凋亡的能力与CS组相比并无显著差别。而对三种水凝胶处理后的hP-MSCs表达的凋亡相关基因进行检测，结果表明，CS-IGF-1C与CS-NO水凝胶能够显著降低BAX/BAD、FAS/FASLG等凋亡相关基因的表达，CS水凝胶可下调FAS/FASLG的表达，其结果与生物发光成像具有相似性（图3）。

图1 hP-MSCsGFP-Fluc的特性Fig 1 The characteristics of hP-MSCs

图2 不同培养条件下细胞的增殖效果Fig 2 Cell proliferation in different culture conditions

图3 不同培养条件下细胞的凋亡情况Fig 3 Apoptosis of cells in different culture conditions

2.4 不同水凝胶对细胞抗炎因子表达的影响 结果表明，CS-IGF-1C水凝胶组TSG-6与PGE2的表达量较高，但CS-NO在一定程度上也能促进hP-MSCs对抗炎因子表达（图4）。因此CS-NO与CS-IGF-1C水凝胶均可与hP-MSCs共移植用于炎性疾病的治疗。

2.5 细胞促血管新生相关因子的表达 结果表明，CS-NO可显著促进VEGF及PDGF的表达，同时，CS-IGF-1C水凝胶对hP-MSCs也有较明显的促进血管新生相关因子表达的作用，而CS在一定程度上也能促进VEGF的表达（图5）。

图4 Real time PCR检测炎性相关因子Fig 4 Real time PCR detected the related inflammatory cytokines

图5 Real time PCR检测促血管新生相关因子Fig 5 Real time PCR detected the angiogenesis related factors

3 讨论

间充质干细胞最早被认为是来源于中胚层和外胚层的一组多能干细胞群体而被人们所熟知，但是随着再生医学的进步，以及对间充质干细胞研究的不断深入，人们发现间充质干细胞可以跨胚层分化，甚至可以分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、心肌细胞及神经细胞等，因此其具有多向分化潜能，在组织修复与再生的医学领域具有广阔的发展前景[1-4,21-23]。此外，间充质干细胞最早是从小鼠骨髓中提取而来，但是由于其数量与分化潜能受年龄的影响，再加上其提取程序复杂，在应用中受到极大限制[24-25]。随后在脂肪组织、脐带、羊水及胎盘中也提取出了间充质干细胞，但是脂肪及羊水中的间充质干细胞的提取受多种条件的限制[26]，而且获取羊水对胎儿及母体有一定的风险；脐带间充质干细胞虽然提取便利，但是其免疫原性比其他间充质干细胞要高。所以胎盘间充质干细胞的优势显而易见：低免疫原性，获取方便，对人体无害，易于培养，多向分化、免疫调节及抗炎能力强，不涉及伦理问题等[27-28]。因此，胎盘间充质干细胞成为众多研究领域的一大热点。

生物发光成像是基于分子影像学的一门技术，早在1999年美国哈佛大学维斯里德教授提出这一概念，并用以检测活体状态下动物体内的细胞及分子水平[29]。而近年来小动物活体成像技术大多被应用于对肿瘤细胞的检测，应用生物发光成像的原理将肿瘤细胞进行荧光素酶的标记，在体外加入荧光素时，荧光素酶与荧光素发生反应释放光子，这种光子在一定的波长内可被小动物活体成像系统捕捉到，从而监测瘤性细胞在体内的转移以及肿瘤的大小[30-32]。与此同时，将小动物体内转入荧光素酶的报告基因，在体外给予荧光素后仍然能够检测目的基因的表达水平[18-19]。而将细胞标记荧光素酶再置于外源的生物凝胶中仍然不影响发光强度[19,33]。在本研究中，我们应用同样的原理，将绿色荧光素酶与萤火虫荧光素酶的报告基因转入hP-MSCs内，使其在正常情况下自发绿色荧光，并且在与萤火虫荧光素结合时发生反应释放光子，再利用小动物活体成像系统便可以监测到细胞移植后的分布及活细胞的数量。

据研究表明，传统的基质胶matrigel3D培养条件下的MSCs具有较明显的促进细胞存活与促血管新生的作用，成功应用在心肌缺血的动物模型中[34]。另外，人血小板裂解液合成的水凝胶在一定条件下也具有促进MSCs增殖与促血管新生的作用，其表征结果也证明了这种水凝胶的安全性[35]。但是，在以往的研究中得知，CS-IGF-1C水凝胶与小鼠脂肪来源的间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）共培养可促进ADSCs的增殖，拮抗H2O2诱导的细胞凋亡，同时具有促进血管新生的作用[19,36]。而CS-NO水凝胶可促进hP-MSCs来源的外泌体对促血管新生的作用，上调VEGF及PDGF的表达[18]。而在本研究中CS-IGF-1C除了具有促进MSCs增殖及抑制凋亡的作用外，还具有促进MSCs的促进血管新生相关因子表达及抗炎相关因子表达的作用。而CS-NO水凝胶促进MSCs的血管新生相关因子表达的作用依然很稳定。因此，本课题组所研制的CS负载的生物活性材料与其他各类已报道的生物材料相比其生物效应可能更加广泛。

综上所述，在以后的研究中可将CS-IGF-1C水凝胶与CS-NO水凝胶应用于MSCs对缺血性疾病的移植治疗，而CS-IGF-1C水凝胶还可应用于炎症性疾病的治疗，这两种水凝胶具有较广的临床应用前景。