中链脂肪酸对脂多糖诱导的断奶仔猪肠黏膜免疫屏障损伤的保护作用

2018-10-23刘聪聪王树辉涂治骁陈少魁汪龙梅王秀英刘玉兰朱惠玲

中国畜牧杂志 2018年10期

刘聪聪，王树辉，涂治骁，陈少魁，汪龙梅，秦琴，张琳，王秀英，刘玉兰，朱惠玲

（武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

小肠是动物消化吸收的主要器官，也是细菌、病毒、寄生虫和过敏大分子等有害物质的物理和免疫屏障[1]。在生猪饲养过程中，仔猪易受各种病原体和非病原体感染，刺激猪产生免疫应激，进而使肠黏膜屏障功能遭到破坏，导致猪肠道通透性增加，使炎症和肠道损伤加剧，最终导致动物器官多功能衰竭[2]。因此，借助于营养调控手段来改善肠道的应激反应对保护肠黏膜结构和屏障功能的完整性非常重要。

中链脂肪酸是由6～12个碳原子组成的饱和脂肪酸，其酯化形式为中链甘油三酯，包括己酸（C6）、辛酸（C8）、癸酸（C10）和月桂酸（C12）。中链脂肪酸不仅能快速供能而且具有抑制有害细菌、改善肠道微生物菌群、降低炎性细胞因子水平、提高新生仔猪免疫功能等生物学特性[3]。中链脂肪酸还可改善哺乳仔猪肠道结构，缓解肠道损伤[4]。

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞膜的成分，LPS注射后3～6 h内会引起肠黏膜形态急性损伤和肠道屏障功能障碍[5]。基于此，本试验旨在研究中链脂肪酸对LPS诱导的断奶仔猪肠黏膜免疫屏障损伤的保护作用，为其在仔猪生产中的推广与应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料 LPS（大肠杆菌血清型O55: B5，Sigma公司）；中链脂肪酸（购自连云港华成饲料有限公司）。玉米油和中链脂肪酸的组成成分见表1。

1.2 试验设计与管理选取24头（21±1）d、体重为（9.0±0.7）kg的杜×长×大三元杂交断奶仔猪，经过7 d预试后，按照体重相近原则随机分为4个处理组，每个处理组6个重复，每个重复1头猪。试验用玉米油作为对照，采用2×2因子设计，主因子分别为日粮处理（中链脂肪酸日粮或玉米油日粮）和免疫应激（LPS或生理盐水）。按照NRC（1998）配制基础日粮，日粮组成与营养成分见表2。中链脂肪酸日粮含有4%中链脂肪酸+1%玉米油，玉米油日粮含有5%的玉米油。试验期为21 d。在试验第21天，每个日粮组中选3个重复注射100 μg/kg 体重（BW）的LPS，剩余的3个重复注射等量的生理盐水。试验期间，猪舍进行常规消毒，仔猪自由采食及饮水。

表1 玉米油和中链脂肪酸的组成成分 %总脂肪酸（重量）

1.3 样品采集与处理本试验注射LPS或生理盐水4 h后屠宰仔猪，剖开腹腔取空肠、回肠样品，制作组织切片。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 绒毛高度和隐窝深度取肠道切片，在10×10倍光镜下，选取10根最长且完整的绒毛，测定绒毛高度、隐窝深度，计算其比值。

1.4.2 上皮间淋巴细胞、杯状细胞数取肠道切片，在40×10倍光镜下，选取6个完好绒毛和隐窝，计数每100个肠上皮细胞内所含淋巴细胞数、杯状细胞数，并计算每张切片上皮间淋巴细胞、杯状细胞平均值。

1.4.3 嗜中性粒细胞数取肠道切片，在40×10倍光镜下，随机选取6个视野计数嗜中性粒细胞数，并测量每个视野的面积，求出该切片嗜中性粒细胞的密度。

1.4.4 固有层细胞密度的测定取肠道肠切片，在40×10倍光镜下，选取6根完好绒毛，计数肠绒毛固有层细胞数，并测量每个固有层的面积，计算该切片固有层细胞密度。

1.4.5 派氏结（Peyers Pathch，PP结）细胞密度取回肠切片，在40×10倍光镜下，选取6个完好的PP结，每个PP结随机选取6个视野计数细胞数，并测量每个视野的面积，并计算该切片PP结细胞密度。

1.5 统计分析数据采用SPSS 22.0进行双因子方差分析。模型主效应包括日粮处理、免疫应激及二者的互作关系。

表2 日粮配方和营养成分（风干基础）

2 结果

2.1 中链脂肪酸对LPS刺激仔猪肠黏膜形态的影响由图1可知，LPS刺激导致空肠绒毛萎缩、上皮脱落；饲粮中添加中链脂肪酸导致空肠绒毛上皮轻度脱落。LPS和中链脂肪酸对肠黏膜形态的影响无互作关系（P＞0.10）（表3）。LPS刺激显著降低空肠的绒毛高度和隐窝深度（P＜0.05），同时显著降低回肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度（P＜0.05）。日粮中添加中链脂肪酸显著提高了空肠绒毛高度（P＜0.05），对回肠黏膜形态没有影响（P＞0.05）。

图1 仔猪空肠黏膜形态

2.2 中链脂肪酸对LPS刺激仔猪肠黏膜免疫屏障的影响上皮间淋巴细胞（多数分布在上皮细胞基底膜附近）和杯状细胞都分布在肠上皮柱状细胞间，以小型细胞为主，胞核大而圆，深染，胞浆少；杯状细胞多呈柱状或圆锥形。由表4可知，LPS刺激显著降低回肠上皮间淋巴细胞及杯状细胞数（P＜0.05），且有降低空肠上皮间淋巴细胞的趋势（P＜0.10）；中链脂肪酸与LPS对空肠杯状细胞（P＜0.05）及上皮间淋巴细胞（P＜0.10）存在互作关系，即中链脂肪酸缓解了LPS刺激导致的空肠杯状细胞数的升高和上皮间淋巴细胞数的减少。嗜中性粒细胞主要分布在小肠黏膜固有层，胞核多为肾形，胞浆丰富。LPS刺激显著增加了回肠嗜中性粒细胞密度（P＜0.05），中链脂肪酸对小肠嗜中性粒细胞密度没有影响（P＞0.10），二者也没有互作关系（P＞0.05）。

由表5可知，LPS刺激显著增加回肠固有层细胞密度（P＜0.05），日粮添加中链脂肪酸降低了空肠、回肠固有层细胞密度（P＜0.05），且LPS与中链脂肪酸之间存在互作关系（P＜0.05），即中链脂肪酸能缓解LPS刺激所引起的空肠固有层细胞密度的增加。LPS刺激可使回肠PP结细胞密度显著增加（P＜0.05）。日粮中添加中链脂肪酸则显著降低了回肠PP结细胞密度（P＜0.05），两者没有互作关系（P＞0.05）。

表3 中链脂肪酸对LPS刺激仔猪肠黏膜形态的影响

表4 中链脂肪酸对LPS刺激仔猪肠黏膜免疫细胞的影响

表5 中链脂肪酸对LPS刺激仔猪小肠黏膜固有层细胞密度和PP结细胞密度的影响

3 讨论

肠道是动物消化吸收的主要器官，同时作为机体最大的保护屏障，可以阻止肠道内病原微生物入侵，保护机体健康[1]。肠黏膜屏障功能的完整性主要由肠黏膜上皮屏障、肠道免疫屏障和肠道内正常微生物群这三大屏障来维持[2]，通过绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度等指标来反映。本试验结果显示，LPS刺激导致空肠绒毛萎缩、上皮脱落，小肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度显著降低，与相关研究结果一致[1]。小肠上皮细胞的更新和屏障功能的维持是一个动态过程，受机体营养水平、饲喂方式及营养素的影响，在应激状态下需要足够的能量来维持和修复小肠的完整性和屏障功能[6]。本研究发现，日粮中添加中链脂肪酸可以提高小肠绒毛高度，这是因为在应激状态下，中链脂肪酸可直接被小肠上皮细胞吸收利用，快速供能以促进上皮细胞的更新和修复，维持肠黏膜屏障功能的完整性。而且有研究表明，中链脂肪酸可以提高小肠绒毛高度，同时降低隐窝深度，对肠道形态有积极的作用[7]。LPS主要引起动物急性的炎症反应和肠道损伤，如果长期用LPS刺激会使仔猪的敏感性降低。饲粮中添加4%中链脂肪酸对仔猪的生长性能并没有影响，这主要是由于仔猪在应激及炎症的情况下，中链脂肪酸可通过保护仔猪肠道形态结构来改善生产性能，而仔猪在健康状况下，饲喂中链脂肪酸不会影响生长性能（数据未发表）。

肠道免疫屏障主要是由肠道免疫细胞和相关淋巴组织组成。上皮间淋巴细胞是肠道免疫屏障的重要组成成分之一，也是机体对抗感染或过敏原的第1道防线，在维持肠黏膜屏障功能方面发挥着重要作用。研究发现，动物小肠黏膜屏障完整性破坏往往伴随着上皮间淋巴细胞数目的减少[8]，中链脂肪酸可降低新生仔猪食糜沙门氏菌和大肠杆菌的浓度，如月桂酸可显著抑制革兰氏阴性菌[9]。本研究中，在LPS刺激后，肠上皮间淋巴细胞数显著降低，说明肠黏膜免疫屏障遭受破坏，而日粮中添加中链脂肪酸则提高了上皮间淋巴细胞数，这可能与中链脂肪酸抑制肠道有害菌群、减少其对肠黏膜的损伤有关。

嗜中性粒细胞作为机体的天然免疫细胞，具有趋化、吞噬和杀菌功能。趋化物质使嗜中性粒细胞渗出血管壁迅速聚集在炎症部位，发挥抗炎和杀菌的作用[10]。本研究表明，肠黏膜的炎症反应是由LPS刺激导致的肠黏膜嗜中性粒细胞密度增加引起的。

固有层中含有大量的免疫细胞（如淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞等），是肠黏膜免疫应答的主要效应场所，也是肠黏膜的过滤器[11]。研究发现，肠黏膜固有层细胞密度增大是由黏膜炎症和抗原刺激引起的[12]。本试验结果表明，LPS刺激可导致肠固有层细胞密度显著增大，表明LPS刺激可引起肠黏膜炎症及屏障功能受损。有研究指出，在鱼油基础日粮中添加中链甘油三酯可以降低小鼠的炎症反应，而且中链甘油三酯可显著降低LPS刺激诱导的炎性细胞因子及趋化因子水平[13]。本研究发现，日粮中添加中链脂肪酸降低了肠固有层细胞密度，说明中链脂肪酸可能降低了LPS刺激导致的炎性细胞因子的升高，对LPS所诱导的炎症反应有缓解作用，维持了肠黏膜屏障功能。

回肠在肠黏膜免疫系统中具有重要的地位，其黏膜层有大量的免疫细胞，黏膜下层还有集合淋巴结即PP结，在归巢受体介导下，PP结中致敏的淋巴细胞可移行到致敏部位的肠黏膜上皮和固有层发挥作用。当机体发生炎症或抗原入侵时，PP结细胞密度增大。本研究中，LPS刺激引起PP结细胞密度增大，表明LPS刺激能够导致肠黏膜出现炎症反应。中链脂肪酸可通过免疫细胞GPR84参与机体的免疫调节，其中辛酸和癸酸都具有抗病毒活性[14]。PP结细胞密度因中链脂肪酸的添加而降低，可能是由于中链脂肪酸参与了机体的免疫调节，对肠道内的病毒入侵有抵抗作用，同时缓解了LPS刺激所导致炎症反应，从而对肠黏膜屏障功能起到保护作用。

杯状细胞可以分泌黏蛋白进入管腔内，从而阻止病原微生物和有害物质的入侵，对黏膜上皮有润滑和保护作用[15]，是机体重要的防御细胞。此外，杯状细胞分泌的三叶因子可减少炎性细胞的浸润，从而起到维护和修复肠黏膜的作用。在本研究中，LPS及中链脂肪酸都降低了肠杯状细胞数。但中链脂肪酸及LPS对肠黏膜杯状细胞的影响未见报道，其机体的机理还有待进一步研究。