棉花VIGS病毒载体的构建及其在抗病基因功能鉴定的应用

李建平，郝晓燕，李琴，高升旗，常晓春，陈勋基，足木热木·吐尔逊，陈果，黄全生

(新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制，属于转录后基因沉默，VIGS具有快速、高效、高通量等优点[1,3]。VIGS可广泛用于大规模筛选，以鉴定感兴趣的表型和基因序列的功能。随着对VIGS载体的不断了解和开发，VIGS体系将会在更多寄主植物上建立，尤其是对于现有载体较难进行基因功能研究的植物上，利用VIGS技术开发新的沉默载体研究这些植物的功能基因。因此，VIGS将成为基因功能研究和植物功能基因组学研究的最有效工具,广泛应用于植物抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因功能的研究[2,7]。【前人研究进展】病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术作为目前公认有效的基因功能研究手段，不仅不受基因种类的限制，而且在多个双子叶植物中得到了应用，已通过该技术在烟草、马铃薯及番茄等植物中发掘出多个与植物抗病反应、代谢调控以及生长发育等相关基因[4,6,7]，也在棉花抗病相关基因的发掘和基因功能研究中发挥了重要的作用。应用该技术，已发现多个与棉花抗病相关的基因[8,9]。【本研究切入点】钙依赖蛋白(CPK)基因家族成员参与了植物生物与非生物胁迫信号途径的调控，在植物防御生物与非生物胁迫方面扮演了重要角色[10,11,12]。VIGS技术目前得到了广泛应用，该技术应用在发掘与黄萎病相关基因方面取得了极大进展[8, 9]。目前，尚未见陆地棉CPK基因家族参与棉花黄萎病抗病调控方面的研究报道。利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术。研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【拟解决的关键问题】构建GhCPKVIGS基因沉默载体，应用VIGS技术体系研究GhCPK基因家族在棉花抗病中的功能。

1 材料与方法

1.1 材 料

陆地棉标准系TM-1为实验室自主保存；菌种：农杆菌菌株GV3101、黄萎病病原菌菌株V991为实验室保存；VIGS病毒载体pYL156及包含TRV::RNAi、TRV::GhCLA1载体的农杆菌菌株由南京农业大学惠赠。

研究所用的卡那霉素、庆大霉素、LB培养基、PDA培养基、Czapeks培养液配制所需试剂及其它化学试剂均为国产分析纯；胰蛋白胨、酵母提取物购自Sigma公司。

Czapek`s培养基：2.0 g/L NaNO3，1.0 g/L K2HPO4，1.0 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L KCl，2.0 mg/L FeSO4·7H2O，30.0 g/L Sucrose。PDA培养基：200.0 g/L 马铃薯，20.0g/L 葡萄糖，20.0 g/L琼脂。LB培养基：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L酵母提取物，10.0 g/L NaCl，15.0 g/L 琼脂(固体培养基加)。YEP培养基：10.0 g/L 胰蛋白胨，10.0 g/L 酵母提取物，5.0 g/L NaCl。

1.2 方 法

1.2.1 棉花种植与培养

棉花种子用浓硫酸脱绒后播种于营养土中，置于光照培养箱中，培养条件为12 h光照/12 h黑暗，温度为23℃。湿度保持在60%及以上，每隔5 d浇一次水，待两片子叶展开且真叶尚未发育时即可用于VIGS操作。

1.2.2 农杆菌介导的VIGS方法

具体操作流程参照Gao and Shan[5]。

1.2.3 棉花的黄萎病病原菌接种

将保存于PDA培养基中的菌株V991转接与新的PDA培养基上进行活化。挑取的菌体于Czapek`s培养液中，25℃，200 r/min，培养3～5 d。将病原菌培养液用4层纱布过滤，利用血球计数板统计病原菌浓度，用灭菌双蒸水调整终浓度至1.0×106个孢子/mL，并加入Tween-20至终浓度0.001%。将棉株从培养基质中取出，保持根部在病原菌悬浮液中1 min后取出移栽至新的培养基质中；接种病原菌后的棉株于湿度达60%及以上的环境下23℃避光生长24 h，后于23℃，12 h光照/12 h黑暗的光周期条件下生长10 d，观察统计棉株黄萎病病症及调查发病指数。

2 结果与分析

2.1 陆地棉GhCPK基因 VIGS片段的克隆

从陆地棉GhCPK基因(基因登录号Gh_D05G3156)序列的保守区域中选取一段532 bp的序列设计引物，并在正向引物5`端引入EcoRⅠ酶切位点，反向引物5`端引入KpnⅠ酶切位点，以陆地棉cDNA为模板，PCR扩增VIGS片段。该片段连接至pEASY blunt zero克隆载体，挑取阳性克隆送至华大基因测序，测序结果与选取的VIGS片段序列一致。图1

注: M,DNA marker；GhCPK为所克隆VIGS片段

Note: M, DNA marker;GhCPK, clonedGhCPKfragment

图1 GhCPK(基因登录号Gh_D05G3156)VIGS片段克隆PCR产物琼脂糖电泳检测
Fig.1 PCR product of GhCPK fragment by agarose gel-electrophoresis mentod

2.2 GhCPK基因VIGS载体构建

将构建至克隆载体的GhCPKVIGS片段用EcoRI 和KpnI 双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳，进行胶回收。同时，用EcoRI 和KpnI 双酶切VIGS病毒载体pYL156并进行胶回收。上述双酶切后的片段与载体使用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化至大肠杆菌中，通过菌液PCR筛选阳性克隆。筛选得到阳性克隆后，提取质粒，用EcoRI和KpnI双酶切进行验证。酶切片段大小与克隆片段大小一致，证明GhCPKVIGS载体构建成功。图2

注: M, DNA marker；1，为所构建的pYL156::GhCPK病毒载体EcoRI与KpnI双酶切结果

Note: M, DNA marker; 1, the double diggested byEcoRI andKpnI results ofpYL156::GhCPKconstruction

图2 pYL156-GhCPK载体酶切鉴定
Fig.2 The double diggested by EcoRI and KpnI results of pYL156::GhCPK construction

2.3 建立棉花VIGS技术体系

为了建立有效的VIGS技术体系，将包含TRV::GhCLA1与TRV::RNAi的农杆菌GV3101共同侵染棉花子叶，若基因沉默效率显著，棉花中与叶绿素合成相关基因GhCLA1基因将发生沉默，棉花的叶绿素合成受到干扰，后期新出现的真叶表现为白化。研究表明，研究所使用的VIGS技术体系的基因沉默效果显著。图3

2.4 利用VIGS技术在棉花中沉默GhCPK基因进行抗病功能

依据同样的操作流程将包含TRV::RNA1与TRV::GhCPK载体的农杆菌对棉花进行共侵染，同时以不含目的基因片段的TRV::pYL156空载体与TRV::RNA1共侵染棉花作为阴性对照，在侵染7～10 d后，参照方法1.3.3对发生基因沉默的棉苗进行病原菌接种，接种10 d后进行表型观察和发病指数调查。结果显示，棉花中的GhCPK基因受病毒诱导发生沉默后，棉花幼苗的较对照更加感病且发病指数高于对照。图4

图3 GhCLA1基因在棉花中的基因沉默效果
Fig.3 The phenotype of silenced GhCLA1 in cotton

图4 GhCPK基因沉默棉花接种黄萎病病原菌后表型及发病指数
Fig.4 The phenotype of silenced GhCPK in cotton and the disease index of cotton infected with Verticillium dahlia

3 讨 论

棉花作为重要的经济作物，其分子生物学和功能基因组相关研究进展远落后于诸如水稻、玉米等作物，究其原因，主要是因为受到分子生物学工具和资源的限制。在此，我们建立了一套适用于较短时间内快速发掘和鉴定棉花基因功能的技术体系：病毒诱导的基因沉默体系(VIGS)。VIGS技术能够稳定的将所研究的目标基因在棉花中发生基因沉默，进而通过作物表型、生理生化指标对目标基因进行功能鉴定[1,2,3]。通过将GhGLA1 VIGS在棉花中进行沉默，棉花叶绿素合成受到阻碍而导致棉花叶片发生白化现象，我们证明了将这一技术体系应用到棉花是行之有效的。

利用此方法，在基因组范围内发掘棉花中特异性的如抗逆、品质相关功能基因显得尤为重要。目前，棉花中存在大量尚未发现的有待研究的与抗病相关的基因，在本研究中，我们利用VIGS技术发现GhCPK基因与黄萎病抗病有关，这只是初步鉴定了该基因在棉花抗病中的功能。但是，如GhCPK基因等抗病基因在棉花中是如何调控棉花激活免疫反应提高抗病性还是未知数，有待深入研究，并且相关分子和遗传机理的研究方法主要参考如拟南芥抗病机理研究，在拟南芥中，大量抗病相关的分子组分及免疫机制研究已经得到了广泛研究。 鉴于拟南芥和棉花在基因组水平都相对保守，研究人员推测这两个物种在抗病防卫机制和基因功能上也是相对保守和类似的[13]。

因此，对于GhCPK基因在棉花抗病防卫机制中的功能及其调控方式研究，我们将参考拟南芥中的相关研究开展，以期今后利用该基因提高棉花抗病性。随着对基因沉默机制的进一步了解和对VIGS病毒载体的不断开发，VIGS体系已经应用于不同植物物种上，尤其是当用常规方法难以进行基因功能研究的植物，利用VIGS技术有利于更多植物功能基因的研究。因此，VIGS将成为基因研究和植物功能基因组学研究的最有效工具。

4 结 论

将病毒诱导的棉花基因沉默体系应用于研究GhCPK基因家族在棉花黄萎病抗病功能，GhCPK基因(基因登录号为Gh_D05G3156)在棉花中发生基因沉默后棉花对黄萎病表现为更加敏感，发病指数明显高于对照，该基因可能参与棉花黄萎病信号调控途径。利用VIGS技术开展GhCPK基因家族成员在棉花抗病中的功能研究相较于传统的基因功能研究是快捷有效的。