GC-MS/MS测定当归中联苯菊酯等三种农药残留的一测多评研究

朱敏凤，余敏灵，张富东

(1.乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000；2.乐山职业技术学院，四川 乐山 614000)

中药材种植及中药饮片加工储存过程中农药的不当使用，均会影响中药材和中药饮片质量，严重危害人体健康[1]。《中国药典》2015年版四部收载了多种有机氯类、有机磷类等农药残留的检查方法[2],近年来，对农药残留量研究报道的文献大多以气相色谱、液相色谱或以其与质谱的联用为主[3-7],我们应用GC-MS/MS法，根据色谱保留时间和质荷比信息对样品进行定性分析，以联苯菊酯二级离子扫描色谱峰(181.1/166.1)面积为参照，计算它与甲氰菊酯二级离子扫描色谱峰(265.1/210.1)面积和溴氰菊酯二级离子扫描色谱峰(252.9/93.0)面积的校正因子，建立应用GC-MS/MS测定当归[2]中联苯菊酯等三种农药残留的一测多评方法，收到了满意的结果，现将实验结果报道如下，以期为GC-MS/MS测定农药残留量提供一测多评[8-10]研究思路。

1 材料

1.1 仪器

GCMS-TQ8030气质联用仪(岛津中国科技有限公司)； Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱，工作站为LabSolutionsGCMSSolutions 版本4.20(岛津中国科技有限公司);Cleanert TPH净化柱(天津博纳艾洁尔公司)。

1.2 试药

联苯菊酯对照品(批号GCB05-2333-2016，100 μg/mL)，甲氰菊酯对照品(批号GCB05-2306-2016，100 μg/mL)，溴氰菊酯对照品(批号GCB05-2310-2016，100 μg/mL)均购自农业部环境监测保护研究所。乙腈(色谱纯，赛默飞科技中国有限公司)，丙酮为色谱纯，氯化钠、无水硫酸钠均为优级纯。当归样品由峨眉山仙山中药饮片公司提供，按中国药典(2015年版)鉴定为当归(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)的根，批号为：20170109,20170322,20170625。

2 方法与结果

2.1 测定原理

以联苯菊酯为对照品测定样品中3种农药残留的原理是利用样品色谱图中联苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的色谱峰相对保留时间进行定位[2]；二级离子碎片图谱中联苯菊酯在166.1、153.1、179.1有碎片离子峰(丰度比为100：5：19，以166.1为参比)，甲氰菊酯二级离子碎片图谱中在210.1、172.1、89.0有碎片离子峰(丰度比为100：14：40，以210.1为参比)，溴氰菊酯二级离子碎片图谱中在93.0、171.9、77.0有碎片离子峰(丰度比为100：84：22，以93.0为参比)；通过定位和二级离子碎片图谱碎片离子峰以及其丰度比对联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯色谱峰进行定性分析。在定量分析时，通过精密量取联苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯对照溶液，配制成不同浓度的混合溶液，按设定条件进样，记录色谱图，绘制进样量对其峰面积的回归曲线，以联苯菊酯回归曲线斜率与甲氰菊酯、溴氰菊酯回归曲线斜率的比计算校正因子(fs/k=Ks/Kk)，通过联苯菊酯回归曲线计算联苯菊酯含量，通过校正因子及联苯菊酯回归曲线计算甲氰菊酯、溴氰菊酯含量[2]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准储备溶液的制备

精密量取联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯标准溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，作为标准储备溶液(每1 mL含联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯各10 μg)。

2.2.2 样品溶液和空白溶液的制备

取当归(20170109)约50 g，粉碎成粉末(过3号筛)，精密称取粉末1.075 3 g，置50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，15 000 r/min匀浆提取1 min，加入2 g氯化钠，再匀浆提取1 min，4 200 r/min离心5 min，取上清液于150 mL鸡心瓶中，再于离心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重复匀浆提取一次，合并提取液，于40℃水浴旋转蒸发至约1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入约2 cm高无水硫酸钠，用10 mL正己烷-丙酮(6∶ 4)预洗后，将样品浓缩液移入柱中，用25mL正己烷-丙酮(6∶ 4)洗脱，收集洗脱液于40℃水浴旋转浓缩至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm滤膜过滤，即得；除称取样品粉末外，按上述操作制备空白溶液。

2.2.3 样品加标溶液的制备

精密称取当归粉末1.021 3 g，按2.2.2项下样品溶液的制备方法，从“置50 mL离心管中起到收集洗脱液于40℃水浴旋转浓缩至近干”，用丙酮转移至1 mL量瓶中，另取标准储备溶液1 mL置10 mL量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 μL至上述1 mL量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀，用0.2 μm滤膜过滤，即得。

2.3 测定条件

2.3.1 气相条件

采用Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱，进样口温度：250℃；线速度：47.2 cm/s；程序升温：50℃保持1 min，以25℃/min速率升至125℃，再以10℃/min速率升至300℃，保持15 min。进样体积：1 μL。载气：高纯氦气(>99.999%)

2.3.2 质谱条件

离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂延迟时间5 min；碰撞气氩气(纯度大于99.999%)；电离方式见表1。

表1 电离方式

2.4 图谱解析

精密量取标准储备溶液25 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按2.3项下测定条件，取对照品溶液、样品溶液、样品加标溶液、空白溶液分别进样，记录色谱图，在对照品溶液二级离子扫描色谱图中有联苯菊酯 (181.1/166.1)、甲氰菊酯 (265.1/210.1)和溴氰菊酯(252.9/93.0)二级离子扫描色谱峰，保留时间联苯菊酯为17.514 min、甲氰菊酯为17.695 min、溴氰菊酯为21.783 min，在空白溶液色谱图和样品溶液色谱图中没有上述色谱峰，在样品加标溶液色谱图中有与对照品溶液色谱图中保留时间一致的联苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二级离子扫色谱峰，如图1；对照品溶液和样品加标溶液的二级离子碎片图谱中联苯菊酯在166.1、153.1、179.1处(丰度比为100∶ 5∶ 19，以166.1为参比)，甲氰菊酯在210.1、172.1、89.0 处(丰度比为100∶ 14∶ 40，以210.1为参比)，溴氰菊酯在93.0、171.9、77.0处 (丰度比为100∶ 84∶ 22，以93.0为参比) 均有二级离子碎片峰，如图2。

注：A.标准品溶液;B.样品溶液;C.样品加标溶液;D.空白溶液1.联苯菊酯;2甲氰菊酯;3.溴氰菊酯图1 二级离子扫描色谱图

注:A．联苯菊酯二级离子碎片图;B．甲氰菊酯二级离子碎片图;C.溴氰菊酯二级离子碎片图图2 二级离子碎片图谱

2.5 线性关系考察

精密量取标准储备溶液5、10、20、25、30、40、50 μL，分置7个5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀。按2.3项下方法测定，以联苯菊酯二级离子扫描(181.1/166.1)峰面积A与联苯菊酯进样量m(ng)进行线性回归，得回归方程：A=10 388 461m-236,r=0.999 7(n=7)，进样量在0.01～0.1 ng范围内与联苯菊酯二级离子扫描峰(181.1/166.1)面积有较好的线性关系；以甲氰菊酯二级离子扫描峰(265.1/210.1)面积A与甲氰菊酯进样量m(ng)进行线性回归，得回归方程：A=523 142m-283，r=0.999 6(n=7)，甲氰菊酯进样量在0.01～0.1 ng范围内与甲氰菊酯二级离子扫描峰(265.1/210.1)面积A有较好的线性关系；以溴氰菊酯二级离子扫描峰(252.9/93.0)面积A与溴氰菊酯进样量m进行线性回归，得回归方程：A=520 881m-144，r=0.999 5(n=7)，溴氰菊酯进样量在0.01～0.1 ng范围内与溴氰菊酯二级离子扫描峰(252.9/93.0)面积有较好的线性关系。

2.6 f值和t值的计算与耐受性考察

2.6.1f值和t值的计算

甲氰菊酯与联苯菊酯色谱峰峰面积的校正因子f甲氰菊酯/联苯菊酯=523 142/10 388 461=0.050 4，相对保留时间t甲氰菊酯/联苯菊酯=17.695/17.514=1.010 3；溴氰菊酯与联苯菊酯色谱峰峰面积的校正因子f溴氰菊酯/联苯菊酯=520 881/10 388 461=0.050 1，相对保留时间t溴氰菊酯/联苯菊酯=21.783/17.514=1.243 7。

2.6.2f值的耐受性考察

实际应用中,色谱条件可能会有一些变化,因此我们对线速度、进样体积可能影响f值的因素进行考察,结果表明,f值的波动不大，见表2。

表2 相对校正因子耐受性考察表

2.7 精密度试验

精密量取标准储备溶液20 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀。按2.3项下测定条件重复进样6次，测得联苯菊酯二级离子扫描色谱峰(181.1/166.1)平均峰面积为410 877，RSD为0.6%；甲氰菊酯二级离子扫描色谱峰(265.1/210.1)平均峰面积21 099，RSD为0.7%；溴氰菊酯二级离子扫描色谱峰(252.9/93.0)平均峰面积20 852，RSD为0.5%。

2.8 重复性试验

精密量取标准储备溶液20 μL，分别置6个5 mL量瓶，加丙酮稀释至刻度中，摇匀。按2.3项下测定条件分别进样，测得联苯菊酯二级离子扫描色谱峰(181.1/166.1)平均峰面积为412 377，RSD为0.4%；甲氰菊酯二级离子扫描色谱峰(265.1/210.1)平均峰面积21 113，RSD为0.6%；溴氰菊酯二级离子扫描色谱峰(252.9/93.0)平均峰面积21 088，RSD为0.5%。

2.9 样品溶液稳定性考察

取2.2.3项下样品加标溶液，按2.3项下测定条件分别在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h进样，结果联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯二级离子扫描色谱峰面积变化不大，RSD分别为1.1%、1.2%、0.9%。

2.10 检出限与定量限

取2.2.3项下样品加标溶液，按2.3项下测定条件测定，测得信噪比(S/N)分别为联苯菊酯44.31、甲氰菊酯50.59、溴氰菊酯11.47，以S/N的3倍计算最低检出限、10倍时计算最低定量限(以进样量计),见表3。

表3 检出限与定量限

2.11 回收率试验

取3.1.2项下粉末9份，每份约1 g,精密称定，分置9个50 mL离心管中，分为3组，每组3份，每组依次加标准储备液4、5、6 μL，按2.2.2项下方法制备样品溶液，取样品溶液按2.3项下测定条件分别进样，记录图谱; 另取联苯菊酯对照品溶液用丙酮稀释至每1 mL含联苯菊酯0.01 μg、0.03 μg、0.05 μg、0.07 μg、0.10 μg的溶液，按2.3项下测定条件分别进样，记录色谱图，计算联苯菊酯二级离子扫描峰面积和进样量间的回归方程得：A=10 400 132m-251(n=5,r=0.999 2)，按回归方程 A=10 400 132m-251计算供试品中联苯菊酯含量；按校正方程A甲氰菊酯=10 400 132mf甲氰菊酯/联苯菊酯-251计算甲氰菊酯含量，按校正方程A溴氰菊酯=10 400 132mf溴氰菊酯/联苯菊酯-251计算甲氰菊酯含量。结果，联苯菊酯平均回收率为93.9%，RSD为1.7%，甲氰菊酯平均回收率为93.5%，RSD为1.6%，溴氰菊酯平均回收率为93.4%，RSD为1.6%，见表4。

表4 联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯回收率试验结果(n=9)

2.12 样品测定

分别取三个批号当归样品(批号为20170109,20170322,20170625)各约50 g，粉碎成粉末(过3号筛)，分别取粉末约1 g，精密称定，按2.2.2项下方法制备样品溶液，取样品溶液按2.3项下测定条件分别进样，记录图谱，并按2.5项下方法计算样品联苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯残留量，结果见表5。

表5 三批样品含量测定结果

3 讨论

当色谱条件有细微改变时，相对保留时间有细微变化，但在该试验中，被测定物质的定性主要采用二级离子碎片峰及其丰度比确认，所以对相对保留时间的耐受性没有进行考察。

仪器建议进样体积不超过1 μL，在相对校正因子f值耐受性考察时，对进样体积0.9、1.0、1.1 μL时的f进行了比较，结果变化不大。

我们对多种药材农药残留的含量测定进行了研究，发现由于中药材含有多种成分，某些成分对测定会有一些干扰，所以在测定具体某一品种时应设计具体的试验参数，并进行相应方法学论证。