广佛手对脂多糖诱导的人肺上皮细胞炎症细胞因子调控的影响

欧明娥，唐铁鑫，吴伟斌

(肇庆医学高等专科学校，广东 肇庆 526020)

肺炎(pneumonia)是儿科四大疾病(肺炎、腹泻 、维生素D缺乏性佝偻病、营养性贫血)防治之首，占5岁以下死亡率的15%，全球2013年死亡人数将近100万[1]，是5岁以下儿童死亡的主要原因之一；也是儿童转诊和入院的主要原因，且发展中国家死亡率明显高于发达国家[2]。因此如何积极有效地防治本病已成为中西医研究的一个重要课题。本研究拟用脂多糖(lipopolysaecharide，LPS)诱发急性肺损伤模型，观察广佛手水提取物和醇提取物对体外培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549释放白细胞介素8(interleukin，IL-8)和白细胞介素10(interleukin，IL-10)的影响，旨在为中药广佛手在儿童肺炎防治中的作用提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

肺泡Ⅱ型上皮细胞A549购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。

1.2 试验药物

广佛手水提取物和醇提取物自行制备。取佛手药材，粉碎，过40目筛。取粗粉50 g，加水，用挥发油提取器提取；提取器内容物滤过，药渣再加8倍水煎煮提取1次，合并2次提取液，取10 mL提取液，置蒸发皿中，水浴加热蒸干得到干固物，粉碎作为水提浸膏粉。取粗粉5 g，加乙醇50 mL，水浴回流提取1 h，过滤，滤液蒸干，干固物粉碎得到醇提浸膏粉。将水提取物和醇提取物溶于无血清RPMI-1640培养基，均制成2 mg/mL备用。

1.3 主要仪器与试剂

仪器设备：CO2培养箱(160i，美国热电);台式超速冷冻离心机(ST-16R，美国热电);超净工作台(BCM-1300A，苏州安泰);十万分之一精密分析天平(MS205DU，梅特勒);液氮生物容器(BioCane 47，美国热电);超纯水仪(Milli-Q Direct-8，美国 MilliQ公司);酶标仪(Multiskan FC，美国热电)。主要试剂及药品:RPMI-1640培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所);胰蛋白酶(美国Gibco公司);CCK8(美国MCE公司);脂多糖(LPS)(美国Sigma公司);IL-8和IL-10检测试剂盒(深圳市达科为生物工程有限公司)。

1.4 细胞培养

将含有肺泡Ⅱ型上皮细胞A549的冻存管从液氮中小心取出，立即轻轻投入预先准备好的37℃水中，远离面部，轻轻顺时针摇动使冷冻管内容物尽快融化，直到冻存管中剩少许冰晶，将冻存管从37℃水浴中取出，用乙醇擦拭消毒冻存管，加入RMPI-1640完全培养液(含10%FCS，pH7.2)稀释后置于离心机，1 000 r/min离心5 min，去除上清液，混悬细胞，按1传1的比例接种于25 cm2培养瓶中，待长到80%时以0.25%胰蛋白酶消化，加入0.45 mL/瓶胰蛋白酶，37℃ 3 min，用0.1 mL移液器轻轻吹打，加入3 mL完全培养基终止消化，用1 mL移液器反复轻柔吹打后，1 000 r/min离心5 min，去上清液，计数后用于实验。

1.5 CCK8法检测广佛手提取物对A549细胞活力的影响

A549细胞用完全培养液制成4×104/mL细胞悬液，100 μL/孔接种于96孔板，37℃5%的CO2培养箱中培养24 h。设置空白对照组和药物处理组，药物处理组加水提取物(终浓度分别为31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)，醇提取物(终浓度分别为31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)，空白对照组加等量无血清培养基，每组设3个复孔，继续培养24 h，随后在每孔中加入CCK8 10 μL，继续培养4 h后弃去上清液。将酶标仪测定波长调为450 nm，检测96孔板各孔吸光度(OD)值，根据公式计算细胞活力(%)，每组实验重复3次，取平均值。公式为：细胞活力(%)=药物处理组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.6 广佛手水提取物和醇提取物对A549细胞释放IL-8的影响

A549细胞用完全培养液制成1×105/mL细胞悬液，接种于12孔板中，置于37℃5%的CO2培养箱中培养，待细胞生长融合后，用于以下实验。随机分为空白对照组、LPS组、水提取物(0.25、0.5、1 mg/mL)组、醇提取物(0.25、0.5、1 mg/mL)组，除空白对照组外，各组加入不同浓度广佛手提取物和LPS(10 μg/mL)，空白对照组加入等量无血清培养基。置37℃5%CO2中培养24 h后进行检测。取培养上清液，3 000 r/min离心20 min后，以酶联免疫法(ELISA)法测定IL-8和IL-10含量。按照试剂盒说明进行步骤。

1.7 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行数据统计，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时用LSD检验，方差不齐时用秩和检验。P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度广佛手提取物对A549细胞活力的影响

由图1可知，广佛手水提取物和醇提取物浓度为31.25～2 000 μg/mL时，与空白组比较，对细胞活力的影响无统计学意义(P>0.05)。

图1 广佛手提取物对A549细胞活力的影响

2.2 广佛手水提取物和醇提取物对脂多糖诱导的A549细胞分泌IL-8的影响

LPS刺激A549细胞24 h后，上清液中IL-8和IL-10含量均升高(P<0.01)，广佛手水提取物三个剂量和醇提取物三个剂量对LPS诱导的IL-8分泌增加呈显著抑制作用(P<0.01)，并存在着一定的量效关系。广佛手水提取物三个剂量在LPS诱导后IL-10分泌明显增加(P<0.01)，而广佛手醇提取物三个剂量对LPS诱导的IL-10分泌增加仅呈抑制作用(P<0.01)。同等剂量水提取物和醇提取物对LPS诱导的IL-8分泌增的抑制作用无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组上清液IL-8和IL-10水平比较

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与LPS组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

3 讨论

肺炎的病因、发病机制复杂，多种炎症细胞因子和炎症介质的过度释放导致促炎-抗炎反应失衡在其中起的重要作用受到了高度关注。一旦促炎和抑炎平衡被打破，可导致全身炎症反应综合征，甚至发生多脏器衰竭。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，又称内毒素，是强烈的炎症启动因子。LPS是导致包括急性肺损伤(acute lung injury，ALI)在内的严重炎性疾病的主要感染性刺激[3],大量文献报道LPS被广泛应用于小鼠ALI模型的制造[4-6]。肺泡上皮细胞不仅是各种损伤因素作用的靶细胞，更是炎性反应的积极参与者，能被LPS激活，释放炎症介质，进而引起细胞的结构损伤、功能障碍和凋亡、坏死等改变，对ALI的发生、发展起着重要作用。

IL-8是一种促炎细胞因子，可趋化中性粒细胞渗出到炎症部位,参与趋化、激活中性粒细胞的全过程。ALL患者中肺泡灌洗液及肺组织中IL-8含量明显增高[7-8]。且IL-8的高血清水平与疾病的严重程度和死亡率相关[9]。IL-10是一种多效细胞免疫因子，IL-10的不同生物学作用依赖于不同的微环境和病理条件。在感染疾病模型中IL-10发挥经典的免疫抑制作用[10]，具有缩短炎症持续时间或减轻其严重程度，对其他细胞因子形成的网络具有调节作用，具有非常强的免疫抑制作用及抗炎作用。IL-10在呼吸道合胞病毒感染中起到重要的抗炎作用，IL-10不仅能阻止急性炎症，而且可以阻止合胞病毒促发Th1/Th2反应[11]。在细菌感染过程中，IL-10亦可以调节包括肺在内的多种器官的细菌感染过程的炎症免疫反应，是指导不同细菌感染过程中免疫应答的最重要细胞因子之一[12]。IL-8、IL-10均参与到肺炎支原体肺炎的发病中，IL-8是发生肺炎支原体肺炎后导致肺部纤维化形成的重要因素，检测IL-10能够了解肺炎支原体肺炎的严重程度[13]。

佛手又名佛手柑、佛手香橼、蜜罗柑等。因产地不同有广佛手、川佛手、金佛手和建佛手之分。主产于广东肇庆等地的称“广佛手”。佛手性温味辛、苦、酸，具有疏肝理气，破积消癥；和胃止呕，消食解酒；豁痰导滞，燥湿止咳等功效。现代研究表明佛手主要含有挥发油、多糖、黄酮等成分，有研究显示佛手醇提取液有镇咳、祛痰、平喘作用[14-15]。

本文结果表明，广佛手水提取物和醇提取物各浓度对肺上皮细胞A549细胞活力无显著影响。LPS可使A549释放IL-8和IL-10增加，提示LPS作用于A549后，A549产生反应性变化，炎症因子IL-8和抗炎因子IL-10分泌释放均增加。广佛手水提取物和醇提取物可减少LPS诱导的A549细胞的炎症因子IL-8释放，提示广佛手对LPS诱导A549细胞IL-8的释放有抑制作用，可减轻肺组织炎症程度，且与浓度呈一定的量效关系。且广佛手水提取物与醇提取物对A549细胞IL-8的释放的抑制作用无明显差异。在抗炎因子IL-10的释放中，广佛手水提取物可明显增加LPS诱导的A549细胞的IL-10释放，而醇提取则减少LPS诱导的A549细胞的IL-10释放增加，提示广佛手水提取物对LPS诱导A549细胞炎症反应有抑制作用，广佛手水提取物与醇提取物在IL-10的释放中的作用不同，这可能源于两种提取方法所得到的成分不同，亦可能与IL-10具有免疫抑制和免疫刺激双向免疫调节作用有关。广佛手中何种有效成分通过何种机制发挥抗炎免疫作用，需要我们进一步探索。