一测多评法测定藜麦中6种酚类成分

魏丽娟,易 倩,张 曲,赵 钢,彭镰心,*

(1.成都大学药学与生物工程学院,四川成都 610106; 2.成都大学农业部杂粮加工重点实验室,四川成都 610106)

藜麦(Chenopodiumquinoawilld)属藜科双子叶植物,是一种新兴的世界作物。藜麦虽然原产于玻利维亚、智利和秘鲁等南美国家,但自上世纪末在中国西藏开始种植以来,藜麦的营养研究与价值挖掘在中国得到了迅速发展,从2008年便开始在中国山西大面积种植,随后在四川、内蒙古、云南、甘肃等地种植[1]。藜麦营养丰富,含有约16%的蛋白质和70%的淀粉[2-4],高于水稻和玉米,和小麦相当,矿物质、纤维素、维生素等含量均高于普通的食物,含有人体所需的全部必需氨基酸,与人类生命活动的基本物质需求完美匹配;同时,藜麦还含有多酚、黄酮、多糖、皂苷等生物活性物质,具有抗氧化、抗炎、降血糖、减肥等生理活性[5-7],是联合国粮农组织确认的唯一一种满足人体基本营养需求的单体植物,被誉为“超级谷物”[8],具有提高人群营养水平和预防多种疾病发生的潜在功效[9]。

酚类成分广泛存在于各种杂粮、水果、蔬菜、茶中,具有广泛的生理活性,能与维生素C、维生素E和胡萝卜素等其他抗氧化物在体内一起发挥抗氧化功效,在人体饮食营养健康中具有重要地位[10-12]。文献表明,藜麦中主要含有咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素等多种酚类成分[13-14],可作为藜麦质量控制指标。藜麦中的酚类成分往往具有协同作用,因此需对其含量进行全面控制,才能更好保障藜麦的品质。然而,由于对照品来源限制,目前藜麦中酚类成分的测定大多采用传统的外标法或内标法控制其中的某个成分,难以保证其质量[15-18]。一测多评法通过计算待测成分间校正因子,可实现在只有一种对照品的情况下同时测定多种成分,已广泛应用于中药材质量评价中[19-22];结合超高效液相色谱的高效分离能力,可实现准确快速的测定藜麦中的酚类成分,为藜麦的质量评价提供新的方法。

本课题组前期研究表明,异荭草素是藜麦酚类成分中含量较高、并且保留时间居中的一种酚类成分[23-24]。有研究表明,异荭草素有抗氧化的作用,主要是通过清除DPPH自由基;同时具有抗炎的作用;除此之外,异荭草素还具有保护脏器,刺激胰岛素分泌、治疗糖尿病的效果;能够使肿瘤细胞活性下降;弱化肝纤维化;抑制肝癌细胞增值;还具抗病毒[25-27]等其他多种功能。因此本实验以5种藜麦为研究对象,选择异荭草素作为参照,即只测定异荭草素这一个成分,通过确定它与咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素间的内在函数关系,通过外标法和一测多评法得到5种藜麦中各酚类成分的含量值,验证一测多评法在藜麦的多指标成分质量评价中的适用性,进而建立藜麦中酚类成分质量控制的方法,为藜麦中酚类成分的测定提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藜麦-1、陇藜1号、陇藜2号、陇藜3号、陇藜4号 农业部杂粮加工重点实验室(成都大学),产地为四川省凉山州盐源县,采收期为2017年8月;咖啡酸对照品(批号:16081501)、对香豆酸(批号:16061805)、阿魏酸对照品(批号:17022303)、异荭草素对照品(批号:16080404)、芦丁对照品(批号:16031602)、槲皮素对照品(批号:16063005) 纯度均大于98%,四川省维克生物科技有限公司;甲醇 色谱纯,安徽天地高纯溶剂有限公司;冰乙酸 色谱纯,成都市科龙化工试剂厂;水 重蒸馏水;其余试剂 均为分析纯。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(QSM四元泵、SM-FTN进样器、CH-A柱温箱、PDA检测器) 沃特世上海科技有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;CP224C十万分之一电子分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司;H2050R高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品的制备 精密称定对照品咖啡酸0.00970 g、对香豆酸0.01004 g、阿魏酸0.00988 g、异荭草素0.00891 g、芦丁0.00826 g、槲皮素0.00602 g分别置于10 mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容至10 mL,制成对照品储备液。分别取对照品储备液适量置于10 mL棕色容量瓶,加甲醇定容至10 mL,制成含咖啡酸19.40 μg/mL、对香豆酸50.20 μg/mL、阿魏酸49.40 μg/mL、异荭草素44.55 μg/mL、芦丁41.80 μg/mL、槲皮素60.20 μg/mL的混合标准品储备溶液,于4 ℃保存,备用。

1.2.2 藜麦中酚类物质的提取 酚类物质的提取参考课题组前期对酚类成分的提取方法做适当调整[23],即取60 ℃烘干至恒重的藜麦粉(过60目筛),精密称定约1.00 g,置于100 mL锥形瓶中,加70%甲醇水溶液25 mL,摇匀并称重,60 ℃超声处理30 min,取出冷却至室温,用70%甲醇水溶液补足质量,摇匀,12000 r/min离心15 min,取上清液,0.22 μm微孔滤膜过滤,取过滤液,待测。

1.2.3 酚类测定色谱条件 ACQUITYUPLC®BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色谱柱;流动相:甲醇(A)-0.2%冰乙酸水溶液(B);梯度洗脱(洗脱程序见表1);检测波长为247 nm;柱温为35 ℃;流速为0.2 mL/min;进样量1 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution sequence

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 线性关系考查 分别精密吸取1.2.1对照品溶液适量,置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀配成不同质量浓度的混合对照品溶液,按1.2.3色谱条件测定,每个浓度分别进样3次,取平均值,以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y),绘制咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的标准曲线,进行线性回归,得到各成分的回归方程及线性范围。

1.2.4.2 待测成分的fs/x的计算 在线性范围内各成分的量与响应信号峰面积呈正比增减,即f=W/A,f表示校正因子,W表示成分的量,A表示仪器响应值。在对藜麦中6种酚类成分进行质量控制时,以异荭草素(s)为内参物,根据公式fs/x=fs/fx=AxCs/(AsCx)(式中,Cs、Cx分别代表内参物与待测物成分质量浓度,As、Ax分别代表内参物与待测成分的仪器响应值),计算异荭草素与咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素之间的fs/x。再通过fs/x方法计算咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素5种成分的量。即取1.2.1的不同质量浓度的混合对照品溶液,按1.2.3色谱条件测定,测定咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的峰面积,以异荭草素为内标物,分别计算各待测成分与异荭草素之间的fs/x。

1.2.4.3 精密度考查 取咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素对照品适量,按1.2.1混合标准品的制备方法制备混标,按1.2.3色谱条件测定,连续进样6次,记录咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的峰面积积分值,以峰面积分别计算RSD值。

1.2.4.4 重复性考查 取藜麦粉末样品(过60目筛)6份,按1.2.2样品溶液的制备方法制备藜麦提取液,按1.2.3色谱条件测定,记录咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的峰面积积分值,以峰面积分别计算RSD值。

1.2.4.5 稳定性考查 取藜麦粉末样品,按1.2.2样品溶液的制备方法,制备藜麦提取液,精密吸取同一样品溶液,分别在0、4、6、8、12、24 h进样1 μL,按1.2.3色谱条件测定,记录咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的峰面积积分值,按峰面积分别计算RSD值。

1.2.4.6 保留时间的考查 取藜麦粉末样品(过60目筛)6份,按1.2.2样品溶液的制备方法制备样品溶液溶液,按1.2.3色谱条件测定,记录咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的峰面积积分值,以峰面积分别计算RSD值。

1.2.4.7 加样回收率考查 取已知含量藜麦样品粉末,精密称取样品约1.00 g,精密称定,共6份,分别加入咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素对照品适量,按1.2.2样品溶液的制备方法制备藜麦提取液,按1.2.3色谱条件测定。计算咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的平均加样回收率和RSD值。

1.2.5 样品测定及一测多评法的验证 取各个品种的藜麦粉末各约1.00 g,精密称定,按1.2.2方法制备藜麦提取液,采用外标法按1.2.3测定5种不同品种藜麦中6种成分含量。再按照建立的一测多评法对待测成分进行色谱峰的定位,以异荭草素为内标,计算其余待测成分含量,并采用SPSS软件对两种方法测得的数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 对照品和样品色谱图

预实验对不同流动相、不同流速、不同波长、不同温度等条件进行研究,结果表明最适检测条件如下:甲醇(A)-0.2%冰乙酸(B)为流动相,流速为0.2 mL/min,检测波长为247 nm,柱温为35 ℃,色谱条件经优化后,咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素分离良好,出峰时间分别为4.473、5.963、6.731、7.221、9.259、14.345 min。样品与对照品色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液色谱图(A)和样品对照色谱图(B)Fig.1 UPLC chromatograms of mixed standard solution(A)and control sample(B)注:1.咖啡酸;2.对香豆酸;3.阿魏酸; 4.异荭草素;5.芦丁;6.槲皮素。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线 通过线性回归分析,得到各成分的回归方程式和线性范围,如表2。结果表明,咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素分别在0.776～19.400、1.004～50.200、0.988～49.400、0.891～44.550、0.836～41.800、3.010～60.200 μg/mL范围内线性关系良好。

表2 藜麦中6种酚类成分的标准曲线Table 2 Standard curve of six polyphenols components in quinoa

2.2.2 相对校正因子 由表3可知,各相对校正因子的RSD值分别为1.60%、1.56%、1.21%、1.17%、2.95%,均小于3%。经分析和综合比较影响相对校正因子的因素,取各质量浓度下获得的相对较正因子(fs/x)的平均值,最终确定咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素与的异荭草素的fs/x分别为1.73、0.32、1.15、0.76、0.56。

表3 5种酚类成分与异荭草素的相对校正因子Table 3 Relative correction factors of isoorientin/five polyphenols components

2.2.3 精密度、稳定性、重现性与回收率 咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异荭草素、芦丁、槲皮素的精密度、重复性、稳定性、相对保留时间、加样回收率的RSD值均小于2%,由此可知仪器的精密度良好,藜麦酚类成分重复性良好,在24 h内稳定;回收率在95%～105%之间,说明该提取方法准确可靠。

表4 精密度、稳定性、重现性与回收率考查结果Table 4 Investigation results of precision,stability,reproducibility and recovery

2.3 一测多评法的验证

为了确认一测多评法的准确性,用外标法进行比较。两种方法得到的含量值之间用Pearson相关系数进行比较,相关系数皆为1.0000,说明两种方法得到的各物质含量的相似性极高;从一测多评法和外标法含量间的相对误差来分析,咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素分别为2.17%、2.79%、1.10%、0.96%、2.3%,亦在3%以内;ESM实际测定含量与本实验所建立的QAMS计算所得含量,经配对t检验结果显示,两种方法所得含量值无显著性差异(p>0.05),说明本实验建立的一测多评法具有较好的准确性和可行性,在藜麦的多指标成分质量评价中应用是可行的。

由表5可知,5个藜麦品种之间异荭草素、咖啡酸、芦丁的含量均存在显著性差异(p<0.05);藜麦-1、陇藜3号、陇藜4号三个品种之间的对香豆酸没有显著性差异(p>0.05),但是分别和其他两个品种之间存在显著性差异(p<0.05);陇藜3号和陇藜4号之间的阿魏酸和槲皮素没有显著性差异(p>0.05),但是分别和其他三个品种之间存在显著性差异(p<0.05);5个品种中,陇藜1号含有最高的异荭草素,含量为370.61 μg/g;陇藜2号含有最高的咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸及槲皮素,含量分别为8.04、300.21、17.75、42.75 μg/g;陇藜-1含有最高的芦丁,含量为35.56 μg/g。此结果也说明,藜麦中酚类成分含量受自身遗传因素的影响,本结果可为藜麦的选育提供参考。

表5 藜麦中6种酚类成分一测多评法(QAMS)与标准曲线法(ESM)测定结果比较(μg/g)Table 5 Comparison of the determination results of six polyphenols components in quinoa by QAMS and standard curve method

3 结论

本实验建立了藜麦中6种酚类成分的一测多评检测方法,考察了重复性、稳定性、精密度、回收率以及保留时间的重复性,结果为RSD值均小于2%,回收率在95%～105%之间,表明藜麦中6种酚类成分的分离良好、组分色谱峰峰形对称、保留时间稳定,仪器精密度良好,方法学考察表明本文所建立方法准确可靠。并且本实验对5种藜麦中6种酚类成分的一测多评法计算值和外标法测定值的测定结果利用SPSS软件进行显著性分析,结果为一测多评法计算值与外标法测定值得到的含量值之间没有显著性差异(p>0.05);通过对5个藜麦品种之间6种酚类物质含量的分析,可知不同的品种之间,6种酚类物质存在差异,其中陇藜2号中含有较高的咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸及槲皮素,本结果可为藜麦的选育提供参考。本实验建立的一测多评法可以在只有异荭草素而无其他对照品的情况下,通过QAMS实现藜麦中其他5种酚类成分的定量,方法准确可行,结果可靠,可用于对藜麦中的酚类成分进行定量。