响应面法优化超声辅助提取甘薯叶多酚工艺

田燕楠,钟耀广,2,3,4,5*



响应面法优化超声辅助提取甘薯叶多酚工艺

田燕楠1,钟耀广1,2,3,4,5*

1. 上海海洋大学食品学院, 上海 201306 2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306 3. 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海), 上海 201306 4. 国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海), 上海 201306 5. 食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学), 上海 201306

采用超声波辅助的方法提取甘薯叶中多酚，并利用响应面法对多酚提取工艺进行优化。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合法研究乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声温度对甘薯叶多酚得率的影响，建立了该工艺的二次多项数学模型。结果表明，甘薯叶总多酚最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数80%，料液比1:22(g/mL)，超声数间47 min，超声温度65 ℃，在此工艺条件下，甘薯叶总多酚得率可达到（15.80±0.014）mg/g，与预测值15.83 mg/g基本相符。

甘薯叶; 总多酚; 超声提取; 响应面法

甘薯叶是甘薯在生长过程中地上秧茎顶端的叶子[1]，甘薯叶中含有丰富的营养成分及活性物质，是天然的营养保健蔬菜，可降低胆固醇，提高人体免疫力，防止心血管脂肪沉积，有抗癌蔬菜的美称[2,3]。甘薯叶中的主要活性成分为多酚类物质，具有清除自由基、抗癌、降低胆固醇、抑菌的作用[4,5]，而甘薯叶中的总酚含量约为菠菜、油菜、卷心菜等常见蔬菜的2~3倍[4]。我国甘薯茎叶资源相当丰富，但是大部分薯藤被当做动物饲料或当做废弃物丢弃，造成资源浪费和环境污染[6]。

超声波辅助提取法因其操作简便、设备简单、提取时间短、提取得率高等优点已广泛应用于植物活性成分的提取[7,8]。其原理是利用超声波机械热震动，产生瞬时的高温和高压促使细胞壁破解，使其内含物质溶出与溶剂充分接触，从而增加提取物的得率[9,10]。响应面法是一种优化复杂过程的统计技术，可以通过回归方程和直观图形分析，高效全面的对实验进行分析[11,12]。Johnson等[13]研究发现在西蒙1号甘薯叶中清除自由基的主要物质是多酚类化合物，并且抗氧化活性与多酚含量存在明显的正相关性。Dini I等[14]对甘薯叶中酚类进行分离鉴定，得到6种咖啡酸及其衍生物，证明这些化合物具有抗突变的作用。目前，甘薯叶的研究主要集中在化学成分、生物学特性等方面[15]，对甘薯叶多酚的提取研究和报道甚少，目前还未发现用超声辅助提取甘薯叶中多酚的报道。

本实验是通过超声辅助提取法，在单因素试验基础上考察乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声温度对多酚得率的影响，结合响应面法对多酚提取工艺进行优化，以期得到多酚提取的最佳工艺，获得更多的多酚物质，为甘薯叶资源的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯叶：2016年9月购于上海浦东新区临港早市，洗净控干70 ℃烘干粉碎，过40目筛，甘薯叶粉密封在自封袋中置于-20 ℃保存备用。

绿原酸标准品：上海源叶生物科技有限公司；福林酚试剂（BR）、碳酸钠（AR）、无水乙醇（AR）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

分析天平（CPA124S）:赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；分光光度计（UV2300）:上海元析仪器有限公司；数控超声波清洗机（DS-351ODT11）:宁波新芝生物科技有限公司；台式高速离心机（TGL-16G）:上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发器（R250B）:上海申生科技有限公司；数显恒温水浴锅（HH-S）:金坛市正基仪器有限公司；鼓风干燥箱(DGG-9203AD):上海森信实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯叶多酚的提取准确称取一定量甘薯叶粉，加入一定量的浸提液（乙醇溶液），放入超声清洗器中在不同条件下浸提甘薯叶多酚，20 ℃条件下3500 g离心10 min，收集上清液，残渣按照上述方法重复提取两次，合并两次上清液，40 ℃真空旋转蒸发除去乙醇，得到甘薯叶多酚粗提液，用去离子水定容至50 mL。

1.3.2 甘薯叶多酚含量的测定采用福林酚比色法[5]测定。取1 mL甘薯叶多酚提取液，加入2.0 mL10%的福林酚试剂，30 ℃避光水浴保温30 min后加入4 mL10%（w/v）碳酸钠溶液，继续30 ℃避光水浴保温30 min，在740 nm处测量吸光度。以绿原酸为标样，制作标准曲线，以标准溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程：=8.94+0.048，2=0.9995。甘薯叶多酚得率按公式（1）计算：多酚得率（mg/g）=12/3(1)

式中：1为总多酚质量浓度(mg/mL)；2为提取液定容体积（mL）；3为提取前茎叶粉末质量（g）。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 乙醇体积分数的选择称取甘薯叶粉末10.0 g，按料液比1:10的比例分别加入体积分数为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，30 ℃超声辅助提取30 min，测定不同乙醇体积分数条件下的甘薯叶多酚得率。

1.3.3.2 料液比的选择称取甘薯叶粉末10.0 g，乙醇体积分数由1.3.3.1确定，料液比为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，30 ℃超声辅助提取30 min，测定不同料液比条件下的甘薯叶多酚得率。

1.3.3.3 超声时间的选择称取甘薯叶粉末10.0 g，乙醇体积分数由1.3.3.1确定，料液比由1.3.3.2确定，30 ℃超声辅助，分别提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，测定不同超声时间下的甘薯叶多酚得率。

1.3.3.4 超声温度的选择称取甘薯叶粉末10.0 g，乙醇体积分数由1.3.3.1确定，料液比由1.3.3.2确定，超声时间由1.3.3.3确定，超声温度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，测定不同温度条件下的甘薯叶多酚得率。

1.3.4 响应面实验设计在单因素试验基础上，根据Box-Behnken实验设计原理，以多酚得率Y为响应值，以A(乙醇体积分数)、B(料液比)、C(超声时间)、D(超声温度)为因变量，设计四因素三水平的响应面分析试验，其中5个中心试验共29个试验点。试验因素水平如表1所示。对响应面试验结果所得数据用Design-Expert 8.0.6软件进行分析和作图。

表 1 响应面试验设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图 1 不同因素对多酚得率的影响

(a)乙醇体积分数对提取得率的影响 Effect of ethyl alcohol volume fraction on extracting yield; (b)料液比对提取得率的影响 Effect of material and ratio on extracting yield; (c)提取时间对提取得率的影响 Effect of extraction time on yield; (d)提取温度对提取得率的影响 Effect of extraction temperature on yield.

如图1（a）所示，随着乙醇体积分数的增加多酚得率呈现先增加当达到80%后又急剧减小的趋势。根据相似相容的原理，可能是80%的乙醇体积分数和多酚极性最为相似，当乙醇体积分数继续增大，二者极性差异增加，影响多酚的溶出[16]。所以乙醇浓度考察范围为70%~90%为宜。

如图1（b）所示，随着料液比的减小多酚提取量逐渐增大，但当料液比小于1:20后，随乙醇量增大多酚含量变化不明显，说明溶出的多酚已经达到饱和，继续增加溶剂用量对提高多酚得率效果不明显。这可能是由于适当增加提取溶剂的体积，提高了料液两相体系的质量浓度梯度，加快了传质推动力[17]，但从节约溶剂和后续分离纯化的角度考虑，料液比考察范围为1:15~1:25（g/mL）为宜。

如图1（c）所示，随着超声时间的延长，多酚提取量逐渐增加，在45 min时达到最大量，继续延长超声时间，多酚提取量下降，可能是由于长时间超声震动使多酚结构遭到破坏[18]，此外超声时间的延长也会增加能量消耗，因此超声时间考察范围定为30~60 min为宜。

如图1（d）所示，甘薯叶多酚提取量随浸提温度的升高呈现先增大后减小的趋势，当温度为60 ℃的时候甘薯叶多酚提取量达到最大，可能是温度升高有利于多酚物质的运动[19]，在超声辅助的条件下不断溶出，当升到一定温度时，多酚物质化学结构可能被破坏，高温还导致乙醇挥发使料液比改变，从而影响多酚的提取[20]。所以提取温度选择50~70 ℃为宜。

2.2 甘薯叶多酚提取工艺条件的优化

2.2.1 响应面实验结果采用Design-Expert 8.0.6软件，根据表2 Box-Behnken设计组合，对表2数据进行二次回归拟合，建立提取工艺参数回归模型。回归方程为：=15.46-0.37A+0.56B+0.38C+0.87D-0.035AB+0.18AC+0.030AD-0.18BC+0.39BD-0.31CD-1.71A2-0.94B2-0.72C2-0.01D2

由方差分析结果可知，二次回归模型<0.0001，模型达到显著水平；失拟项值为0.0691>0.05，失拟项差异不显著，表明模型与实验拟合程度良好，无失拟因素存在；试验模型的校正系数Adj R2为0.9567，变异系数CV值为1.88%，说明该模型只有4.33%的变异不能由该模型解释。因此，利用此方程模型确定超声辅助提取甘薯叶多酚工艺参数是可行的。

由回归模型的显著性检验可知，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，说明对多酚得率影响显著，交互相BD、CD的P值小于0.05，说明料液比和提取温度，超声时间和超声温度交互显著。由F值的大小可知，这四个因素对甘薯叶多酚提取量的影响大小为：D（超声温度）>B（料液比）>C（超声时间）> A（乙醇体积分数）。

2.2.2 响应面分析及最佳工艺研究利用Design-Expert 8.0.6软件对各因素之间的交互作用做出相应的响应面曲线图和等高线图。图2~7分别显示6组以多酚得率为响应值的趋势图。响应面图可直观反映出试验因素对多酚得率影响的两两交互作用的显著程度，响应面坡度越陡峭，说明响应值对操作条件的改变越敏感[21]，该因素对多酚得率的影响越大；反之则说明试验条件对多酚得率影响越小。在交互项对多酚得率的影响中，料液比与超声温度、超声时间与超声温度之间的交互作用显著，其它因素之间交互作用不显著，这与方差分析结果一致。

表 2 响应面试验设计及结果

表 3 回归模型方差分析

注：*差异显著，<0.05。Note: * showed the difference was significant at 0.05 level.

图 2 乙醇体积分数和料液比的响应面和等高线图

图 3 乙醇体积分数和提取时间的响应面和等高线图

图 4 乙醇体积分数和提取温度的响应面和等高线图

图 5 料液比和提取时间的响应面和等高线图

图 6 料液比和提取温度的响应面和等高线图

图 7 提取时间和提取温度的响应面和等高线图

利用Design-Expert 8.0.6软件分析计算出理论最佳提取工艺条件：乙醇体积分数79.98%，料液比1:21.96，超声时间46.44 min，超声温度64.92 ℃，此时多酚得率最高达到15.83 mg/g。为了验证模型的有效性，同时结合实际操作情况将最佳工艺条件修改为乙醇体积分数80%，料液比1:22，超声时间47 min，超声温度65 ℃，在此工艺条件下重复三次进行验证性实验，得甘薯叶多酚得率为（15.80±0.014）mg/g，与预测值15.83 mg/g偏差不大，说明模型能较好的预测甘薯叶中多酚得率，优化工艺条件可靠，具有实用价值。

3 结论

本研究是在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken中心组合法优化了甘薯叶多酚提取工艺，建立了该工艺的二次多项数学模型。由响应面分析结果知各因素对甘薯叶多酚得率的影响程度依次为：超声温度>料液比>超声时间>乙醇体积分数，其中超声温度对甘薯叶中多酚提取量影响最显著，交互项中料液比与超声温度，超声时间与超声温度交互作用显著。综合回归模型和验证试验，最终确定了超声辅助提取甘薯叶多酚的最佳参数：乙醇体积分数80%，料液比1:22，超声时间47 min，超声温度65 ℃，在此条件下甘薯叶多酚得率为（15.80±0.014）mg/g，与预测值15.83 mg/g基本一致，具有一定的实际意义。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Polyphenols from Sweet Potato Leaves by Response Surface Methodology

TIAN Yan-nan1, ZHONG Yao-guang1,2,3,4,5*

1.201306,2.201306,3.()201306,4.()201306,5.201306,

The polyphenol in sweet potato leaves was extracted by ultrasonic - assisted method, and extraction process was optimized by response surface method. On the basis of single factor experiment, the effects of ethanol volume fraction, ratio of material to liquid, ultrasonic time and ultrasonic temperature on polyphenol yield of sweet potato leaves were studied by Box-Behnken central group method. The results showed that the optimum extraction conditions were ethanol concentration of 80%, solid- liquid ratio of 1:22g/mL, extraction time of 47min, extraction temperature of 65 ℃. Under these conditions, the yield of total polyphenols in sweet potato leaves was (15.80 ±0.014) mg/g, which was basically consistent with the predicted value of 15.83 mg/g.

Sweet potato leaves; total polyphenol; ultrasonic - assisted extraction; response surface methodology

TS255.1

A

1000-2324(2018)05-0894-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.05.035

2017-04-04

2017-04-26

田燕楠(1992-),女,在读硕士生,研究方向为食品营养与安全. E-mail:2270134374@qq.com

通讯作者:Author for correspondence. E-mail:ygzhong@shou.edu.cn