一种复合中草药对草鱼非特异性免疫功能的影响

邢玉娟,程安达,吕慧源*,赵志超,王志明,孙艳霞



一种复合中草药对草鱼非特异性免疫功能的影响

邢玉娟1,程安达2,3,吕慧源2,3*,赵志超2,3,王志明2,3,孙艳霞2,3

1. 江苏农牧科技职业学院, 江苏 泰州 225300 2. 北京生泰尔科技股份有限公司, 北京 102600 3. 北京市中兽药工程技术研究中心, 北京 102600

为研究一种复合中草药对鱼体非特异性免疫功能的影响，本文采用单因子浓度梯度法，在基础饲料中分别添加0.05%、0.10%、0.20%的复合中草药，以空白饲料组为对照，试验组和对照组各设3个平行，每个平行为30尾草鱼。通过测定血液白细胞吞噬活性、血清和组织溶菌酶（Lysozyme，LSZ）活力、超氧化物歧化酶（Superoxide dismatase，SOD），评价草鱼非特异性免疫功能。结果：实验组草鱼白细胞吞噬能力极显著高于对照组（<0.01），0.10%组白细胞吞噬能力显著高于0.05%组（<0.05）、与0.20%组无显著差异（>0.05）。0.05%组、0.10%组和0.20%组的血清LSZ活力分别比对照组提高18.63%、28.60%和21.96%（<0.01）。0.10%组肝胰脏的LSZ活力极显著高于0.05%组和对照组（<0.01），0.20%组显著高于对照组（<0.05）。3个试验组鳃LSZ活力均极显著高于对照组（<0.01）。复合中草药对血清和肝胰脏的SOD活力无显著影响。但对草鱼鳃SOD活力有显著影响，0.10%组和0.20%组鳃SOD活力显著高于对照组（<0.05）。结论：复合中草药可通过提高白细胞吞噬能力、提高组织溶菌酶（LSZ）及超氧化物歧化酶（SOD）活性来增强草鱼的非特异性免疫功能，中草药为无抗生态养殖提供了新的思路选择。

复合中草药; 草鱼; 非特异性免疫

草鱼()是中国重要的养殖经济鱼类[1]，近年来，草鱼的病害流行日趋严重，给生产造成了巨大损失。使用抗生素类药物治疗鱼病有许多不利因素，如安全性降低及抗药性增强等，因此，研究和开发提高草鱼抗病力的药物，尤其是通过饲喂给药的方式定期进行有效的预防是解决问题的有效办法。目前，一些学者研究了单味中草药对鱼类免疫功能及防病能力的影响[2-4]

中草药毒副作用小，易分解，无残留，无致癌、致畸、致突变作用，已在我国人、畜和禽上使用多年，效果显著[5-7]。病害日益严重，为了预防疾病发生，筛选对草鱼抗病的中草药免疫增强剂迫在眉睫。目前有研究显示，中草药确实能增强鱼类细胞免疫和体液免疫，从而增强其抗病力。这些工作说明中草药免疫增强剂在鱼类养殖上具有巨大的应用前景。

鱼类的非特异性免疫应答为鱼体正常的生理学反应，对鱼类的生长、抗病具有重要意义。表征鱼体非特异性免疫能力的指标很多，如：血清和组织溶菌酶（Lysozyme，LSZ）活力、超氧化物歧化酶（Superoxide dismatase，SOD）活力、白细胞吞噬能力、抗蛋白酶活力、I型干扰素活力等。与上述指标关联的化学物质有LSZ、SOD、抗蛋白酶、转移因子、补体、C-反应蛋白、几丁质酶、I型干扰素等，其合成、分泌、发挥生理作用等环节均受到鱼类机体营养状况的影响。早在1983年人们就开始注意到饲料成分对养殖鱼类免疫能力的影响。通过调整饲料成分[8,9]，改善鱼类营养状况，可以提高养殖鱼类免疫功能，减少养殖鱼类病害的发生。

本研究以草鱼鱼种为实验对象，在基础饲料中添加复合中草药，研究复合中草药对草鱼非特异性免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计

采用单因子浓度梯度法，在基础饲料中分别添加0.00%、0.05%、0.10%、0.20%的复合中草药。复合中草药由“北京生泰尔科技股份有限公司”提供。成分为黄芪、甘草、板蓝根、大青叶等，规格100 g/袋，每100 g相当于原生药500 g。以不添加复合中草药的基础饲料组为对照，试验组和对照组各设3个平行，每个平行为30尾草鱼。

1.2 试验饲料

基础试验饲料用HKJ-219型环模制粒机制成=2 mm的硬颗粒，自然晾干，备用。饲料成分及营养水平见表1。

表1 试验饲料组成及营养水平

1.3 饲养管理

试验草鱼来自靖江市滨江水产良种场。将其饲养于12只2.0 m×0.1 m×0.6 m的室内水泥池中，随机分组。每个水泥池放养30尾草鱼，初始体重为108.33±11.26 g。试验采用饱食方式，每天投喂3次（9:00、13:00、17:00）。试验期间水温为26±2 ℃，各组水质完全一致。每周刷洗水泥池1次，防止藻类附着生长。试验周期为60 d，60 d后取样检测结果。

1.4 样品制备

从每个鱼缸随机取10尾鱼，从尾静脉取血。其中5尾制备抗凝血，加1%肝素抗凝，4 ℃放置，避免振荡，防止溶血，另5尾制备血清，将所抽取的全血4 ℃放置5 h，10000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清，-20 ℃保存待测。抗凝血用于血液白细胞吞噬活性试验，血清用于LSZ活力和SOD活力测定。

将取过血的试验鱼立即解剖，剪取肝胰脏和鳃，用预冷的0.65%生理盐水冲洗去除血液，剪去肝胰脏表面附着的结缔组织，再用滤纸吸干表面水分，称重后置于-20 ℃冰箱中保存。测定时，将样品解冻，加1倍体积的4 ℃、0.65%的生理盐水，在冰浴条件下，玻璃匀浆器中匀浆，匀浆液6000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清测定肝胰脏、鳃的LSZ活力和SOD活力。考马斯亮兰法测定上述两种组织的蛋白含量。

1.5 白细胞吞噬活性测定

1.5.1 金黄色葡萄球菌菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌（）接种于淡水鱼类琼脂培养基(FWA)斜面上，28 ℃培养24 h。用0.65%无菌生理盐水洗下菌落，用1%福尔马林、28 ℃灭活24 h，调整细菌浓度到1×108CFU/mL，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.5.2 白细胞吞噬功能试验取0.5 mL抗凝血，加入0.2 mL灭活的金黄色葡萄球菌菌悬液，充分混匀，28 ℃振荡孵育1 h，然后取上述混合液制备血涂片，自然晾干后滴加甲醇固定10 min，蒸馏水冲洗，Giemsa染色1 h，冲洗，晾干。油镜观察并记录结果。按照下式计算吞噬率（Percentage of phagocytosis，）与吞噬指数（Phagocytic index，）。

（%）=100×(1)

式中为吞噬率；为视野中参与吞噬的白细胞数；为视野中白细胞总数。

=(2)

式中为吞噬指数；为吞噬入白细胞内的细菌总数；为参与吞噬的白细胞数。

1.6 血清、肝胰脏和鳃LSZ活力测定

1.6.1 溶壁微球菌菌悬液的制备溶壁微球菌（）冻干粉购自Sigma公司。使用时，接种于FWA斜面培养基上，28 ℃培养24 h，传代3次。然后用0.65%无菌生理盐水洗下菌落，配制菌悬液，浓度以OD570约为0.3为最佳。保存于4 ℃冰箱中备用。

1.6.2 LSZ活力测定步骤取2 mL溶壁微球菌菌悬液于试管内冰浴10 min，加入0.2 mL血清后混合均匀，立即测定其吸光值1，然后28 ℃水浴条件下精确反应15 min（肝胰脏和鳃的匀浆上清液反应时间为45 min），立即进行10 min冰水浴，终止反应，混匀后在波长570 nm下测定吸光值2。LSZ的活力（U）按下式计算：LSZ（U）122(3)

1.7 血清、肝胰脏和鳃总SOD活力测定

血清、肝胰脏和鳃总SOD活力测定[10]采用南京建成生物工程研究所的SOD测定试剂盒。SOD活力单位定义为：每毫克组织蛋白的1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位。

1.8 数据处理

采用SPSS 11.5 for windows和EXCEL进行one-way ANOVA分析和LSD比较。结果以平均数±标准差（MEAN±SD）表示。

2 实验结果

2.1 草鱼白细胞的吞噬活性

由表2可见，在草鱼基础饲料中添加复合中草药，提高了白细胞的吞噬活性。0.05%复合中草药组、0.10%复合中草药组和0.20%复合中草药组的值极显著高于对照组（<0.01）。试验组中，0.10%组的值显著高于0.05%组（<0.05），但和0.20%组无显著差异（>0.05）。0.05%组和0.20%组的值无显著性差异（>0.05）。饲料中添加复合中草药对白细胞的无显著性影响（>0.05）。

表2 草鱼血液白细胞的吞噬活性

备注：同一行大写字母不同表示差异极显著（<0.01）,小写字母不同表示差异显著（<0.05）。下同。

Note: Capital in each column with difference is extremely significant (<0.01), lowercase letter differences indicate significant differences (<0.05).The same below.

2.2 复合中草药对血清、肝胰脏和鳃LSZ活力的影响

复合中草药能显著提高草鱼血清、肝胰脏和鳃中的LSZ活力（表3）。

0.05%组、0.10%组和0.20%组的血清LSZ活力较对照组分别提高18.63%、28.60%和21.96%（<0.01）。3个试验组相比较，0.10%组血清LSZ活力显著高于0.20%组（<0.05）、极显著高于0.05%组（<0.01），而0.05%组和0.20%组之间无显著差异（>0.05）。

肝胰脏中LSZ活力变化趋势和血清中LSZ活力变化趋势基本一致。0.10%组肝胰脏的LSZ活力最高，极显著高于0.05%组和对照组（<0.01），与0.20%组无显著差异（>0.05）。0.20%组肝胰脏LSZ活力显著高于对照组（<0.05），和0.05%组无显著差异（>0.05）。

3个试验组鳃LSZ活力均极显著高于对照组（<0.01）。0.10%组鳃LSZ活力较0.05%组显著提高（<0.05），和0.20%组无显著差异（>0.05）。0.05%组和0.20%组鳃LSZ活力无显著性差异（>0.05）。

表3 草鱼血清、肝胰脏和鳃LSZ活力/U

2.3 复合中草药对血清、肝胰脏和鳃SOD活力的影响

由表4可见，添加复合中草药对血清和肝胰脏的SOD活力无显著性影响（>0.05）。复合中草药对鳃SOD活力有显著影响，其中0.10%组、0.20%组鳃SOD活力显著高于对照组（<0.05），但0.05%组与对照组鳃SOD活力无显著差异（>0.05）。0.05%组、0.10%组和0.20%组三组之间无显著差异（>0.05）。

表4 草鱼血清、肝胰脏和鳃SOD活力

3 讨论

鱼类血液中具有吞噬能力的白细胞主要有粒细胞、巨噬细胞和单核细胞[11]。鱼类的粒细胞可分为嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞。但是，不是所有的鱼类都同时具有这3种粒细胞。单核细胞存在于所有硬骨鱼血液中。鱼类的巨噬细胞或单核细胞可释放与哺乳动物的Ⅰ-Ⅱ型白细胞介素和转移因子相似的物质。鱼体白细胞在消化病原生物的同时可保留有关抗原信息并且将其传递给相关的淋巴细胞，从而激发机体的体液免疫和细胞免疫。

本研究复合中草药的使用可以提高草鱼血液中白细胞的吞噬能力，王吉桥[12]等在牙鲆上的研究也得到类似的结果，虽然中草药的种类以及鱼的种类都不同，但说明有些中草药确实发挥了一定的作用。其原因可能是饲料中添加复合中草药，改善了草鱼体内环境，促进了营养物质的消化吸收，从而提高了草鱼的营养水平，进而改善了鱼体的免疫状态，提高了机体免疫水平，相应地提升了白细胞的吞噬能力。

LSZ是鱼体内重要的非特异性防御因子，是鱼体生理防御水平的重要标志。LSZ是一种碱性水解酶，主要作用于细菌细胞壁粘多糖的-1,4糖苷键，同时对真菌、寄生物以及病毒也有破坏作用。因此，它在鱼类抵抗传染性疾病时起着重要作用。鱼体中LSZ的产生与哺乳动物相似，主要由嗜中性粒细胞和单核细胞产生，少量由巨噬细胞产生。LSZ在鱼的粘液、血清、相关免疫器官及肠、鳃、肝、胃等组织中广泛分布，其活力受遗传、温度、食性等诸多因素的影响。血清与肝胰脏在鱼体内识别外来异物及免除异物侵害中发挥着重要作用，而鳃是病原体进入体内的通道，故鳃LSZ的主要功能是阻止病原入侵。

本试验在草鱼饲料中适量添加复合中草药，能提高肝胰脏、血清、鳃LSZ活力。可能也是因为复合中草药能提高草鱼的消化吸收能力，特别是提高了鱼体对脂肪、蛋白质及其它营养成分的利用率，另外，血液中白细胞吞噬能力的提高是导致LSZ活力提高的另一个重要原因。

自1969年Mccord和Fridovich报道SOD的酶学特性以来，以SOD为中心的生物活性氧代谢研究进展很快，迄今已形成了生物活性氧伤害学说。SOD属于金属蛋白酶，主要分布于胞浆和线粒体的基质中。是生物体内清除活性氧，防止生物分子损伤，免受细胞氧化伤害的关键酶之一。机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切关系，该防御体系包括酶促和非酶促两个体系，SOD是酶促体系的重要组成部分。SOD能够阻断脂质过氧化作用，是抗氧化系统中的关键性酶，也是机体免疫调节网络的重要组成部分，其活力受O2-的调控。

草鱼代谢过程中，机体会产生大量的O2-和H2O2等活性氧，这些活性氧具有一定的杀菌作用，同时也对动物体本身有毒害作用，需要SOD及时清除。饲料中添加复合中草药后，发现其鳃部的SOD活力显著提高，可以更好的清除体内的自由基，改善机体的健康状况。

综上，在草鱼基础饲料中适量添加复合中草药，可以一定程度地提高草鱼机体的非特异免疫水平，主要表现在草鱼机体白细胞吞噬能力的提高，LSZ活力的提高以及草鱼鳃部抗氧化机能的提高这几个方面。其机理还有待探索，但不影响其作为一种新型的饲料添加剂应用到饲料中，来增加鱼体的抗病能力。中草药的合理应用为无抗生态养殖，提供一种可供选择的思路。

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Effects of a Compound Chinese Herbal Medicine on Nonspecific Immune Function of

XING Yu-juan1, CHENG An-da2,3, LV Hui-yuan2,3*, ZHAO Zhi-chao2,3, WANG Zhi-ming2,3, SUN Yan-xia2,3

1.225300,2.102600,3.102600,

In order to study the influence of a compound Chinese herbal medicine on the nonspecific immune function of, experiments were conducted using single factor concentration gradient method. 0.05%, 0.10% and 0.20% of compound Chinese herbal medicine were added to the basic feed. The blank feed group was taken as the control group, and 3 parallel groups were set for each group, with 30 tails grass carp in each group. The nonspecific immune function of grass carp was evaluated by measuring the phagocytic activity of blood leukocytes, the activity of serum and tissue lysozyme (Lysozyme, LSZ) and superoxide dismutase SOD). Results: The phagocytic ability of grass carp leukocytes in the experimental group was significantly higher than that in the control group (<0.01), the phagocytosis of leukocytes in 0.10% group was significantly higher than that in 0.05% group (<0.05), but there was no significant difference between 0.20% group (>0.05). Compared with the control group, the serum LSZ activity in group 0.05%, 0.10% and 0.20% increased by 18.63%, 28.60% and 21.96% (<0.01) respectively. LSZ activity of liver pancreas in 0.10% group was significantly higher than that in 0.05% group and control group (<0.01),and that in the 0.20% group was significantly higher than that in the control group (<0.05), the activity of gill LSZ in 3 experimental groups was significantly higher than that of control group (<0.01). There was no significant effect of compound Chinese herbal medicine on SOD activity of serum and liver pancreas. However, the SOD activity of gill in 0.10% and 0.20% group was significantly higher than that in the control group (<0.05). Conclusion: Compound Chinese herbal medicine can enhance the nonspecific immune function of grass carp by increasing the phagocytic ability of leukocytes and the activities of tissue lysozyme (LSZ) and superoxide dismutase (SOD). Chinese herbal medicine provides a new way of thinking for non-resistant ecological cultivation.

Compound of Chinese herbal medicine;;nonspecific immune.

S965.112

A

1000-2324(2018)05-0782-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.05.011

2017-01-10

2018-01-10

邢玉娟(1964-),女,大学本科,副教授,主要从事动物医学临床教学与实践. E-mail:1903048595@qq.com

通讯作者:Author for correspondence.E-mail:lvhuiyuan0507@163.com