正交实验法优化姜黄油及姜黄素提取工艺

羊青,王茂媛,晏小霞,王清隆,王建荣,王祝年

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，海南 儋州 571737)

姜黄为姜科植物姜黄(CurcumalongaL.)的干燥根茎，产于我国四川、福建、云南等省区，东亚及东南亚地区广泛栽培，为药食同源植物，被称为“21世纪的健康明星”，除了作为传统药物使用之外，还广泛用作着色剂、调味品、香料及防腐剂。姜黄性味辛、苦、温；归心、脾、肝经，具有活血、散瘀、疏肝解郁的功效，可用于治疗胸胁刺痛、闭经、风湿疼痛等[1]。姜黄中含有多种成分，主要为挥发油和姜黄素类化合物，此外还含有糖类、甾醇类等成分。姜黄挥发油为带有芳香性气味的油状物质，主要成分为姜黄烯、芳姜黄酮等萜类物质，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效[2-6]。姜黄的黄色物质为略带酸性的酚类物质，是姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的混合体，称为姜黄素，具有利胆保肝、降血脂、活血通经、抗生育、抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗艾滋病毒、抗动脉粥样硬化、预防老年痴呆[7-12]等生理和药理作用。姜黄挥发油的提取方法主要包括水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、超临界CO2流体萃取法等[13-15]，其中水蒸气蒸馏法具有提取设备简单，简便易操作，对溶剂纯度要求不高等优点，在工业生产上更为常用。姜黄素提取方法主要有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等[16-18]，其中以乙醇作为溶剂提取较为常用。本实验应用正交实验设计方法对常用的姜黄油和姜黄素的提取方法进行优化，提高姜黄中有效成分的提取效率。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

UV-2100紫外可见分光光度计、AY220分析天平 日本岛津公司；XL-04A中药材粉碎机 广州金本机械设备有限公司；N-1001(2 L)立式旋转蒸发器 上海爱朗仪器有限公司；DHG9035A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.1.2 试剂

实验采用的姜黄采自海南省，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王祝年研究员鉴定为姜科植物姜黄的根茎。姜黄素标准品(HPLC≥98%，Sigma公司)，无水乙醇(分析纯，广州化工)。

1.2 方法

1.2.1 姜黄挥发油的提取

将收集的新鲜姜黄根茎洗净烘干，并将其粉碎，过筛，干粉备用。参照《中国药典》2010年版一部挥发油测定法(附录XD甲法)，根据实验设定的因素，分别提取挥发油。姜黄油得率按下式计算：姜黄油得率=读取的挥发油体积(mL)/姜黄粉末质量(g)×100%。

1.2.2 姜黄素的提取

姜黄素不溶于水和乙醚，易溶于乙醇和冰醋酸，工业上常用乙醇提取，因此本文采用乙醇溶液提取法。

1.2.2.1 乙醇回流法

(1)准确称量样品，加入圆底烧瓶中，加入75%乙醇溶液，混匀；(2)连接好回流冷凝管，将水浴锅温度调至80 ℃，加热1.5 h；(3)将提取液过滤，往圆底烧瓶中加入乙醇溶液，加热1.5 h再提取2次，合并滤液，并用乙醇溶液清洗样渣2～3次；(4)将滤液用乙醇溶液定容至250 mL，待测；(5)用分光光度计测定待测液吸光度值，并计算出姜黄素含量。姜黄素含量计算方法如下。

1.2.2.2 绘制标准曲线

将标准品配制成0.05 mg/mL 的75%乙醇溶液；

将标准品溶液与样品溶液在300～500 nm处扫描，找出最高吸收峰，得出吸收波长为430 nm；

吸取不同量的标准品溶液，用75%乙醇稀释，得浓度分别为0.8，1.0，2.0，4.0，8.0 μg/mL溶液，在分光光度计上分别测定吸光度。以标准曲线浓度与吸光度(两者的关系见表1)分别为横、纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.1914x+0.01615，R2=0.9998，RSD=0.00815，其中x代表溶液浓度，y代表吸光度。

表1 相对浓度与吸光度的关系

1.2.2.3 样品含量测定

取1 mL样品溶液用75%乙醇稀释至10 mL，得稀释液1。取0.5 mL稀释液1用75%乙醇稀释至10 mL得稀释液2，分光光度计测定其吸光度，用回归方程计算出样品浓度。姜黄素含量由下式计算得到：

1.3 姜黄挥发油提取正交实验

根据单因素实验结果，选取浸泡时间(A)、提取时间(B)、料液比(C)、粉碎粒度(D)为考察因素，以提取挥发油体积为考察指标，进行L9(34)正交实验。每因素平行3次，RSD值均在数据可用范围内，结果取平均值。

1.4 姜黄素提取正交实验

根据单因素实验结果，选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、粉碎粒度(D)为考察因素，以提取姜黄素提取率为考察指标，进行L9(34)正交实验。每因素平行3次，RSD值均在数据可用范围内，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 姜黄挥发油提取正交实验

应用L9(34)正交实验设计，优选最佳提取工艺参数。在单因素实验结果的前提下，设置了正交实验表，各因素水平见表2，实验结果见表3。

表2 姜黄挥发油提取正交实验因素水平表L9 (34)

表3 姜黄挥发油提取正交实验结果

通过均值计算和极差分析得知，各因素对姜黄挥发油提取效果影响大小的顺序为提取时间(B)>粉碎粒度(D)>料液比(C)>浸泡时间(A)。各因素水平的最佳组合为A1B2C1D3或A3B2C1D3。挥发油得率最高的组合为第8号实验A3B2C1D3，该组合与L9(34)正交实验结果一致。为了进一步验证最佳工艺条件，对组合A1B2C1D3和A3B2C1D3再次进行验证实验。验证结果发现2组实验的挥发油得率基本一样，由此可知A因素(浸泡时间)对实验结果几乎没有影响，考虑到提取效率，故后续实验方案药材均不浸泡。最终确定最佳提取工艺为提取时间6.0 h，料液比1∶20(g/mL)，粉碎粒度80目。

2.2 姜黄素提取正交实验

应用L9(34)正交实验设计，优选最佳提取工艺参数。在单因素实验结果的前提下，设置了正交实验表，各因素水平见表4，实验结果见表5。

表4 姜黄素提取正交实验因素水平表L9(34)

表5 姜黄素提取正交实验结果

通过均值计算和极差分析得知，各因素对姜黄素提取效果影响大小的顺序为乙醇浓度(A)>粉碎粒度(D)>提取时间(B)>提取次数(C)。各因素水平的最佳组合为A2B3C2D3或A2B3C3D3，即乙醇浓度75%，提取时间2.0 h/次，提取次数2次或3次，粉碎粒度80目。因素C中，提取3次比提取2次姜黄素含量增加明显，而提取4次与提取3次差异不大，为了缩短周期，决定提取3次，即选用A2B3C2D3组合。姜黄素含量最高的组合为第4号实验A2B1C2D3，这与正交实验计算出的最优组合A2B3C2D3仅有B因素每次提取时间存在差异。为了进一步验证最佳工艺条件，在不改变因素A，C，D的条件下，对B因素的3个水平同时进行验证，即对组合A2B1C2D3，A2B2C2D3，A2B3C2D3进行验证。结果显示，3个组合的姜黄素含量分别为3.20%，3.23%，3.24%，组合A2B3C2D3姜黄素含量最高，但其与A2B2C2D3组合结果差异不大，即每次提取1.5 h与提取2.0 h的结果差异不明显。因此将每次提取时间确定为1.5 h，由此确定最佳工艺为乙醇浓度75%，提取时间1.5 h/次，提取次数3次，粉碎粒度80目。

3 结论

采用水蒸气蒸馏法，应用L9(34)正交实验设计，优化姜黄挥发油的提取工艺。根据预实验结果，设置了4个影响因素，即提取时间、粉碎粒度、料液比和浸泡时间，并分别设置了3个水平进行工艺筛选。通过均值计算和极差分析得知，各因素对姜黄挥发油提取效果影响大小的顺序为提取时间>粉碎粒度>料液比>浸泡时间。通过验证实验发现浸泡时间对实验结果几乎没有影响，为了提高效率，药材均不浸泡。在通过比较实验后，确定了最佳工艺组合为A1B2C1D3/A3B2C1D3，即提取时间6.0 h，料液比1∶20(g/mL)，粉碎粒度80目。采用乙醇溶液回流法，应用L9(34)正交实验设计，优化姜黄素的提取工艺。根据预实验结果，设置了4个影响因素，即乙醇溶液浓度、提取时间、提取次数和粉碎粒度，并分别设置了3个水平进行工艺筛选。通过均值计算和极差分析得知，各因素对姜黄素提取效果影响大小的顺序为乙醇浓度>粉碎粒度>提取时间>提取次数。实验中发现每次提取1.5 h与提取2.0 h的结果差异不明显，为了节省时间，提高效率，将每次提取时间确定为1.5 h。由此确定采用的工艺组合为A2B2C2D3，即乙醇浓度75%，提取时间1.5 h/次，提取次数3次，粉碎粒度80目。此实验方法有效地提高了海南产姜黄有效成分的提取效率。