通窍散瘀方微乳的制备及评价*

贾 山，张紫薇，谭佳威，杨 冰，白 洁，李鹏跃，杜守颖，陆 洋

（北京中医药大学中药学院，北京 100029）

通窍散瘀方原方为王永炎院士临床经验方，由葛根、白芍、薄荷脑等药味组成，用于治疗急性脑中风，疗效确切。方中主要成分有葛根素、芍药苷和薄荷脑。主要药效成分为葛根素、芍药苷。葛根素具有扩张冠状动脉、抗心肌缺血，抑制血小板凝集、改善脑循环[1]、对脑缺血及缺血再灌注引起的神经细胞损伤具有保护作用[2-3]。芍药苷对脑神经元有保护作用[4]，薄荷脑在一定浓度范围内能够促进葛根素的渗透，当浓度达到5 mg/mL时具有显著促渗作用[5]。通窍散瘀方在临床上主要以水煎液给患者。而方中主要药效成分葛根素在水和油中的溶解度都很低[6]，提高葛根素的生物利用度非常必要。为了发挥该方速效急救的临床疗效，研制一种安全稳定并使有效成分能够直达脑部的剂型非常必要。微乳作为一种新型的纳米制剂，具有脑靶向、低刺激性和高稳定性的特点。

本研究首先通过伪三元相图制备通窍散瘀方微乳，并对其理化性质、含量、刺激性进行评价。

1 材料

仪器LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司，SPD-M20A，PDA检测器；LCSolution色谱工作站）；磁力搅拌器（金坛区华城润华实验仪器厂）；激光粒径测定仪（Zetasizer Nano ZS，英国马尔文仪器有限公司）；TK-20B型透皮扩散试验仪（上海皆凯科技贸易有限公司）；葛根素提取物（北京普博欣生物科技有限责任公司，批号PB10624-1）；芍药苷提取物（北京普博欣生物科技有限责任公司）；薄荷脑提取物（北京普博欣生物科技有限责任公司，批号PB31210）；葛根素对照品（110752-201615）；芍药苷对照品（110736-201441）；肉豆蔻酸异丙酯IPM（麦克林）；油酸乙酯（北京化工厂）；油酸（北京化工厂）；蓖麻油聚氧乙烯35（阿达玛斯试剂公司）；辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯（labrasol）（嘉法狮（上海）贸易有限公司）等；SD大鼠，雄性，体质量（180～220）g[北京维通利华实验动物技术有限公司许可证编号：SCXK（京）2006-2009]。

2 方法与结果

2.1 葛根素在各油相、乳化剂、助乳化剂中的溶解度考察

2.1.1 色谱条件 十八烷基键合硅胶柱；甲醇-水（37∶63）（1%醋酸）；流速 1.0 mL/min；检测波长：250 nm，柱温：25℃，进样量：20μL。

2.1.2 标准曲线的绘制 精密称取葛根素对照品适量，用甲醇溶解并稀释成浓度为613.000、367.800、122.600、61.300、24.520、2.452 μg/mL 的葛根素标准供试液。按照上述色谱条件，进样20μL，记录峰面积。以样品色谱峰面积A对浓度C进行线性回归，结果表明，葛根素在2.452～613μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=51 121 441.36X-34 622.21，r2=0.999 9。

2.1.3 精密度实验 取高、中、低质量浓度（613、367.8、2.452 μg/mL），连续进样 3 次，记录峰面积，计算RSD值0.33%、0.17%、0.000 80%。表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性实验 分别在2、4、6、8、10、12 h测样品含量。计算RSD值，RSD值为1.79%，表明12 h内样品稳定性良好。

2.1.5 溶解度实验 测定葛根素在不同油相（IPM、油酸、油酸乙酯中）、不同乳化剂（EL-35、吐温80、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）、不同助乳化剂（1，2-丙二醇、无水乙醇、丙三醇、PEG400、Transpol p（二乙二醇单乙基醚））中的溶解度。室温下，在足量的葛根素中，分别加入5 mL的各溶媒，搅拌48 h，使药物充分溶解。在 3、9、12、24、48 h 取点，每次取300μL。然后于5 000 r/min下离心15 min，精密量取上清液100μL，甲醇定容到10 mL，HPLC测定葛根素含量。结果见1～2。

结果显示，对于油相，IPM、油酸、油酸乙酯，葛根素在其中的溶解度均小于0.1 mg/g，说明葛根素在油中的溶解度很低，因此选择这3种油相作进一步的研究。葛根素在3种表面活性剂中的溶解度都大于40 mg/g，且大小差不多，因此选择这3种乳化剂进行进一步的实验。对于助乳化剂，葛根素在1，2-丙二醇的溶解度为254.83 mg/g，明显高于在其他助乳化剂的溶解度。因此选择这1，2丙二醇作为助乳化剂。

图1 葛根素在不同乳化剂中的溶解度

图2 葛根素在不同助乳化剂中的溶解度

图3 微乳的伪三元相图

2.2 微乳油相的筛选 精密称取EL35作为乳化剂，1，2-丙二醇作为助乳化剂，乳化剂和助乳化剂按质量比（Km）为1∶1混合均匀，制成混合乳化剂。将混合乳化剂分别与IP M、油酸乙酯、油酸，按质量比 9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例精确称量，置于西林瓶中，25℃恒温，350 r/min磁力搅拌混合均匀，以去离子水滴定，每滴一次待其充分混合均匀，观察液体的形态变化，同时以入射光照射，观察是否有丁达尔现象，记录体系的临界变化点。计算临界点时每个组分在微乳体系中的质量百分含量，借助O-riginPro8.0软件绘制微乳的伪三元相图，确定O/W型微乳区。结果见图3。

结果显示，EL35-1，2丙二醇-IPM-水微乳区面积最大。微乳区面积大者，微乳的稳定性较好。所以选择IPM作为油相。

2.3 微乳乳化剂的筛选 精密称取IPM作为油相，1，2-丙二醇作为助乳化剂、EL-35、吐温 80、（Labrasol）为乳化剂，将各乳化剂和助乳化剂按质量比（Km）1∶1，混合均匀，制成混合乳化剂。将不同的混合乳化剂与 IPM，按质量比 9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例精确称量，置于西林瓶中，后面的实验操作同2.2。结果见图4。

结果显示，以Labrasol作乳化剂的处方，在任何比例下都不可形成微乳。而以EL35，吐温80为乳化剂的微乳面积比较，EL35的微乳区面积大者，选择乳化剂EL-35。

2.4 微乳Km值的筛选 精密称取EL35作为乳化剂和1，2-丙二醇作为助乳化剂按质量比（Km）为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 分别混合均匀，制成混合乳化剂。将混合乳化剂与 IPM，按质量比 9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8 和 1∶9 的比例精确称量，置于西林瓶中，后面的实验操作同2.2。结果见图5。

结果显示，当Km=1∶1时，微乳区面积最大，选择 Km=1∶1。

图4 不同微乳乳化剂的伪三元相图

图5 不同km值的伪三元相同

2.5 最佳空白微乳处方的筛选 在筛选出的以IPM为油相、EL-35为乳化剂、1，2丙二醇为助乳化剂，Km值为1∶1的伪三元相图中，筛选13个点作进一步研究。乳化剂的用量一般为处方的40%～60%，油相为5%左右。

采用马尔文激光粒径测定仪，对已经选择的微乳区域内的13个处方进行粒径和多分散指数（PDI）测定。以形成微乳的外观、粒径、PDI作为衡量指标综合考虑，选择最佳处方配比，作为最优处方。结果见表1。

结果显示，处方2、处方5和处方13，外观澄清透明，PDI小，比较稳定。将这3个处方进行进一步实验。

2.6 最佳载药微乳处方的筛选 考察葛根素载药量 500、600、700、800、900、1 000 mg葛根素。芍药苷和薄荷脑按照处方比例添加到空白微乳处方中。处方比例为葛根素：芍药苷：薄荷脑=2∶1∶0.8。将空白处方2，处方5和处方13加入各药物之后，制得载药微乳，在常温下放置，处方13载药500 mg在第2天析出，处方5载药500 mg在第10天析出，处方2载药 500、600、700 mg，放置不析出，根据最大载药量原则，最终选择载药量700 mg。

2.7 通窍散瘀微乳处方设计 设计空白处方总量为 10 g，IPM 0.519 g，1，2-丙二醇 2.923 g，EL35 2.923 g，水3.635 g，其中载药葛根素700 mg，芍药苷280 mg，薄荷脑 350 mg。

2.7.1 通窍散瘀微乳制法 取10 mL西林瓶，按照处方比例依次加入1，2丙二醇、EL35、葛根素，25℃恒温水浴，以350 r/min搅拌，使其充分溶解。加入薄荷脑、IPM。搅拌，使其充分溶解,作为A相。另取芍药苷提取物加入相应量的纯净水中搅拌使其充分溶解，作为B相。将B相逐滴加入A相中，不断搅拌使混合均匀，即得。

2.8 通窍散瘀方微乳pH值测定 取3个批号的通窍散瘀方微乳各10 g，置于西林瓶中，将pH酸度计校正平衡后，测定3个样品的pH值。

结果显示，醒脑静鼻用微乳的平均pH值为5.31，而正常生理状态下，鼻腔内pH值为4.5～6.5，在此PH值下，生物适应性良好[7]。

2.9 微乳中葛根素和芍药苷含量测定

2.9.1 色谱条件Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，柱温 30℃；流动相乙腈-甲醇-水（15∶10∶75）；流速1.0 mL/min；葛根素检测波长250 nm；芍药苷检测波长230 nm；进样量10μL。

2.9.2 标准曲线的建立 分别精密称取葛根素、芍药苷对照品6.64、5.2 mg，加甲醇配制成葛根素浓度为0.066 4 mg/mL，芍药苷浓度为0.013 mg/mL的对照品储备液。配置成一系列葛根素浓度为66.40、33.20、16.60、8.30、6.64、3.32 μg/mL 的对照品溶液。芍药苷浓度为 26.00、13.00、6.50、3.25、2.60、1.30 μg/mL，摇匀，得到标准溶液系列。按上述色谱条件依次进样。以测得峰面积A与其浓度C线性回归，得葛根素标准曲线方程Y=37 784 682.811 1X+22 121.591 5，r=0.999 4，线性范围 3.32～66.40 μg/mL，芍药苷标准曲线方程 Y=12863791.6530X+4071.5616，r=0.9994，线性范围 1.300～26.00μg/mL。

2.9.3 专属性考察

2.9.3.1 空白体系微乳的配制 精密称取微乳1.0644g，15000r/min 离心 10min，取上清液，于 10mL容量瓶中，加甲醇定容。取1 mL加到25 mL，加甲醇定容。取1mL加到10 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.9.3.2 样品溶液的配制 精密称取微乳1.005 0 g，15 000 r/min离心10 min，取上清液，于10 mL容量瓶中，加甲醇定容。取1 mL加到25 mL，加甲醇定容。取1 mL加到10 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.9.4 精密度实验 取同一对照品溶液，重复进样6次。葛根素峰面积RSD=0.13%，芍药苷RSD=0.40%，表明本实验的方法精密度良好。

2.9.5 重现性实验 取同一批样品6份，分别制成供试品溶液，按含量测定法测定，结果葛根素，RSD=0.19，芍药苷RSD=0.61，表明本实验的方法重现性良好。

2.9.6 稳定性考察 取载药微乳溶液，按照供试品的处理方法制成待测液后，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h进行测定，记录峰面积值，葛根素RSD=0.17，芍药苷RSD=0.74，表明供试品在处理后24 h保持稳定。

2.9.7 载药微乳的含量测定 取3批样品，依供试品溶液的处理办法制成供试品溶液，按照2.9.3项下进行测定，结果如下表2～3。

表2 载药微乳中葛根素的含量

表3 载药微乳中葛根素的含量

2.9.8 粒径 采用激光散射法测定了空白微乳和载药微乳的，取稀释10倍的载药微乳适量，用马尔文粒径仪测定自微乳的粒径和Zeta电位，记录粒径及电位。载药微乳的平均粒径（直径）为17.86 nm，PDI为0.031，Zeta电位为-4.90 mV。空白微乳的粒径和电位与载药微乳差异不大，结果见图6～7。

图6 载药微乳的粒径

图7 载药微乳的电位

3 通窍散瘀微乳对大鼠鼻黏膜和纤毛刺激性、损伤性作用及可逆性研究

大鼠共21只，随机分为4组，其中载药微乳组、空白微乳组、药物混悬液组各6只，生理盐水组3只。第1天给药3次，每次给药50μL，在给药后的第2天和第8天分别处死3只大鼠（生理盐水组第2天处死）。取鼻中隔软骨（带黏膜），苏木精-伊红（HE）染色，石蜡切片，做光镜观察，结果见图8～9。

结果显示，HE染色下生理盐水组大鼠鼻粘膜病理切片中可见无上皮细胞无增生，排列整齐，杯状细胞少，固有层无水肿。通窍散瘀微乳组病理切片可见上皮细胞的纤毛脱落，固有层水肿，腺体增生，血管不同程度扩张并略微充血。通窍散瘀微乳恢复1周组的大鼠病理切片大鼠鼻黏膜恢复正常。通窍散瘀药液组大鼠鼻黏膜切片可见杯状细胞增多，腺体增生，血管不同程度扩张并有充血现象。通窍散瘀药液恢复1周组大鼠鼻黏膜未恢复正常，仍可见杯状细胞增多，腺体增生，血管不同程度扩张并有充血现象。

图8 给药第2天倒置显微镜下观察图（40×）

图9 给药8天后倒置显微镜下观察图（40×）

4 讨论

方中的葛根素是难溶性成分，提高葛根素溶解度很重要。首先采用溶解度实验初步选出乳化剂、助乳化剂、油相，再以滴水法绘制伪三元相图，单因素考察乳化剂、助乳化剂、油相，进一步筛选出合适的乳化剂、助乳化剂、油相。以粒径、PDI为指标，确定乳化剂、助乳化剂、油相的比例。再以载药量为指标，确定处方中各药物的量，最终制备载药微乳。

通窍散瘀微乳能显著提高难溶性药物葛根素的载药量，并且形成均一稳定的体系。可为通窍散瘀方给药提供新的剂型。

通过大鼠鼻中隔切片实验研究结果可以发现，以生理盐水作为对照组，通窍散瘀微乳给药后有一定毒性，然而在给药1周后切片观察，发现其纤毛再生，细胞在恢复，表明通窍散瘀微乳虽对大鼠鼻黏膜和纤毛产生刺激性，但其可以恢复。说明微乳对鼻腔的刺激性具有可逆性，可为通窍散瘀方给药提供新的剂型。