基于COⅠ基因的羚羊角及其混伪品的DNA条形码鉴定方法的研究

王桂梅　王世伟　席啸虎　张小慧

中图分类号 R282.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）01-0077-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.20

摘 要 目的：考察利用细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因对羚羊角及其混伪品进行分子鉴定的可行性。方法：收集4个地区的羊角类整角、不完整角样品，共7个。比较样品骨塞部位和角质层部位DNA的提取效果，采用聚合酶链式反应（PCR）技术，以通用引物LCOⅠ490、HCO2198扩增样品的COⅠ基因，通过凝胶电泳、纯化（取750 bp条带）、测序后，以COⅠ基因作为条形码比对序列，采用NCBI数据库中的Blast软件在线比对，确定收集样品的具体物种。结果：样品以角质层部位进行DNA提取的效果较好（DNA浓度为15.7～22.6 ng/?L，260 nm/280 nm吸光度值为1.73～4.72）；在线比对结果显示，所有样品COⅠ基因的相似性均达到99%，其主要来源于赛加羚羊、藏羚羊、普氏原羚、山羊、绵羊等羊类的角。结论：基于COⅠ基因的DNA条形码技术可用于羚羊角及其混伪品的鉴定，该技术为羊角类药材的鉴定提供了一种准确、客观的方法。

关键词 细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因；羚羊角；混伪品；序列比对；鉴定

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the feasibility of molecule identication of Saiga tatarica and its adulterants by using cytochrome C oxidase subunit Ⅰ （COⅠ） gene. METHODS：A total of 7 horns and incomplete horns were collected from 4 areas.The extraction effect of DNA from bone plug and stratum corneum were investigated； PCR technology was used to amplify COⅠ gene of samples using universal primer LCOⅠ490， HCO2198； after gel electrophoresis， purification （750 bp strip） and sequencing， using COⅠ gene as barcode alignment sequence， online comparison was conducted by using Blast software of NCBI database to determine specific species. RESULTS：The extraction of DNA from stratum corneum was better （DNA concentration was 15.7-22.6 ng/?L， the absorbance of 260 nm/280 nm was 1.73-4.72）. Online comparison showed that the similarity of COⅠ gene in all samples reached 99%， mainly from the horns of saiga antelope， Tibetan antelope， gazelle， sheep and goats. CONCLUSIONS： DNA barcode technology based on COⅠ gene can be used for the identification of S. tatarica and its adulterants. The technology can provide an accurate and objective method for the identification of horn medicinal materials.

KEYWORDS Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ； Saiga tatarica； Adulterants； Sequence alignment； Identification

牛科動物赛加羚羊的角是羚羊角药材的法定来源，但是市场上存在多种羊角类混伪品，如山羊角、绵羊角、黄羊角等。传统鉴定主要依赖样品的完整性及经验丰富的鉴定专家，一般药材验收人员难以鉴定。现代分子学技术可通过分析样品的遗传物质，从而实现对物种的鉴定，不受样品存在状态的影响。动物线粒体中的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因被认为是全球动物物种鉴定的通用条形码[1]，其片段序列可作为一种新的物种身份识别系统，常采用聚合酶链反应技术（PCR）获得COⅠ基因序列，然后通过DNA提取、扩增、测序、比对等步骤来分析正品及其混伪品。该技术已被证实可用于多种动物药材的不同组织样本的鉴定[2-5]，并取得了较好的研究结果。然而，该技术对坚硬样品（如羚羊角）鉴定的可行性尚缺乏深入研究。鉴于此，笔者收集了多种羊角类不同存在状态（整角、丝、不完整角）的样品，以COⅠ基因为目的基因，通过比较对骨塞部位与角质层部位DNA的提取效果后，采用PCR技术，以通用引物LCOⅠ490、HCO2198扩增样品的COⅠ基因，通过测序序列比对确定收集样品的具体物种来源，从而为羊角类药材的鉴定提供一种准确、客观的方法。

1 材料

1.1 仪器

BSA124S型电子天平（上海赛多利斯贸易有限公司）；LX-200型迷你离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；T960型PCR热循环仪（杭州晶格科学仪器有限公司）；DYY-6B 型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；ZF-258型全自动凝胶成像仪（上海嘉鹏科技有限公司）；Nano Drop 2000型DNA浓度测试仪（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.2 药材与试剂

共收集4个不同地区的羊角类整角、不完整角样品7个；离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（批号：Q5330）、普通DNA产物纯化试剂盒（批号：DP204）均购自天根生化科技有限公司；DL 2000 DNA Marker（100～2 000 bp）（大连宝生物工程有限公司，批号：A1801A）；6倍浓度的核酸样品用上样缓冲液[大连宝生物工程（大连）有限公司，批号：A301A]；2×Easy Taq SuperMix PCR反应预混液（北京全式金生物技术有限公司，批号：J11122）；Gold View I型核酸染色剂、二硫苏糖醇（DTT）、葡聚糖凝胶、三羟甲基氨基甲烷（TRIS）、二水合乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）等均购自北京索来宝生物科技有限公司（批号分别为20160217、20160603、20150902、121750709、308D061）。样品信息详见表1，实物图详见图1。

2 方法与结果

2.1 骨塞部位DNA的提取

2.1.1 脱钙液的制备 称取186.1 g的EDTA-Na2·2H2O，加入800 mL蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌，滴管滴加NaOH溶液（1mol/L），用pH计调节pH至8.0，然后用蒸馏水定容至1 L，配成0.5 mol/L的EDTA（pH 8.0）脱钙液，高压灭菌后备用[6]。

2.1.2 脱钙时间及脱钙次数的考察 取样品3，用电锯切割横截面，将骨塞部位取出，用干净刀片削取骨塞成粉末。然后称取样品粉末5份（编号1～5），每份25 mg，加入5倍取样量的EDTA（pH 8.0）脱钙液，分别在4 ℃下脱钙12、24、48、72、84 h（每24 h更换1次脱钙液），5 000×g离心3 min，弃脱钙液，其余按试剂盒提取步骤提取样品总DNA，并测定DNA的浓度及纯度，以260 nm/280 nm波长样品吸光度（A）的比值（A260/A280）考察提取DNA的质量，纯DNA的A260/A280≈1.8。A260/A280<1.8，提示有蛋白质或苯酚污染；A260/A280>1.8，说明样品中含有RNA[7]。样品3骨塞部位不同脱钙时间的DNA提取效果见表2。

结果，脱钙12～48 h，样品未完全裂解，但随着脱钙时间延长，DNA浓度升高；脱钙48～84 h，样品裂解透彻，但提取的DNA浓度降低。提示选择骨塞部位提取DNA，易受提取时间和提取次数的影响，提取时间过短，样品裂解不完全；提取时间过长和提取次数过多，DNA被破坏，提取的DNA浓度低，无法进行下一步的PCR操作。所以，角类药材的DNA提取研究，应避免取骨塞部位。为有效提取角类药材的DNA，笔者取角质层部位，进一步研究其DNA的提取方法。

2.2 角质层部位DNA的提取方法研究

2.2.1 取样 整角样品用电锯切割横截面成片状，取片状横截面，用小刀刮去外层污染后，削成细薄片，备用；丝状样品用75%乙醇清洗3次，双蒸水冲洗至无醇味，紫外光下照射，晾干，消毒剪剪成碎片，备用。

2.2.2 DTT对角质层部位DNA提取效果的影响 称取羚羊角细薄片（样品3）30 mg，加入蛋白酶K 20 ?L及裂解缓冲液200 ?L后，56 ℃金属浴过夜裂解，此时样品几无变化。称取羚羊角细薄片（样品3）30 mg，加入DTT 100 ?L、蛋白酶K 20 ?L及裂解缓冲液200 ?L，56 ℃金属浴裂解30 min后，样品裂解明显。可见，加入DTT可促进样品裂解。

2.2.3 样品3角质层部位DNA提取效果 在预试基础上，称取羚羊角细薄片（样品3）25 mg，加入DTT 20 ?L、蛋白酶K 20 ?L及裂解缓冲液200 ?L，56 ℃金属浴裂解3 h，裂解透彻后，按试剂盒提取步骤提取角质层样品总DNA。结果，DNA浓度为16.2 ng/?L，远高于骨塞部位的DNA浓度，且提取時间短，故后文选取骨质层部位进行DNA提取。

2.2.4 所有样品角质层部位DNA提取效果 分别取7种样品各25 mg，按“2.2.3”项下方法进行DNA提取。结果，所有样品DNA浓度均高于15.0 ng/?L，样品1和样品5的A260/A280接近1.8，证明蛋白质去除干净，其余样品的A260/A280>1.8，说明样品中可能含有降解的RNA，所有样品的提取结果见表3。

2.3 PCR扩增、纯化和测序

PCR扩增程序参考文献[8]。反应体系总体积为25 ?L，包括DNA模板10 ?L，正、反向引物各1 ?L（浓度均为10 mmol/L），2×Easy Taq SuperMix预混液12.5 ?L，最后用双蒸水补足体系体积至25 ?L。用含有Gold View I 型核酸染色剂的1.5%琼脂糖凝胶点样，在TBE缓冲液（由TRIS、硼酸、EDTA混合配制而成）中电泳；凝胶成像仪成像，割取750 bp的条带，按纯化试剂盒说明书操作纯化后送上海桑尼公司测序。7种样品PCR扩增的电泳图见图2。

2.4 序列比对与鉴定

所有样品均成功测序后，采用DNAStar软件中的MegAlign进行多序列比对，分析所收集的7个样品的COⅠ基因序列的相似与差异。其中，羚羊角、未知角丝、未知角块的序列相同，并与其余角类序列有差异。进一步用NCBI数据库中的Blast软件在线比对各序列在数据库所对应的物种来源。结果，各样品序列与数据库中的序列相似性均达到99%，确定了未知不完整样品的具体物种，鉴定了黄羊角的原动物为普氏原羚角，同时证明收集的其余样品的物种名称均是正确的。7种样品多序列比对结果见图3，鉴定结果见表4。

3 讨论

线粒体基因中的细胞色素氧化酶基因有3个亚基：COⅠ、COⅡ、COⅢ基因，其中COⅠ基因相对保守，其序列能够区分物种差异，已用在鱼类、鸟类、两栖类等物种的鉴定与识别上，是动物物种鉴定的通用条形码。近年用COⅠ基因鉴定的动物药材品种有广地龙[3]、蛤蚧[9]、药用软体动物[10]、金钱白花蛇[4]等，并取得较好的鉴定结果。本文分析用该基因鉴别羊角类药材的可行性，首先分别对骨塞部位和角质部位研究其DNA提取效果，因骨塞部位的DNA提取受脱钙次数和脱钙时间影响，耗时长，且所得DNA浓度较低，因此，角类药材的DNA提取应避免取骨塞部位。当选择采用角质层部位提取DNA时，在提取时间段内，可获得更高的DNA浓度，虽然羚羊角整角和黄羊角整角的A260/A280值分别为1.73和1.79，但是接近1.80，即使有少量蛋白质或苯酚污染对常规PCR测定也影响不大。虽然纯的DNA样品要求 A260/A280≈1.8，但在本研究实例中比值大于1.8的DNA提取样品PCR均能成功扩增，且不影响测序。本研究在通过PCR扩增，凝胶电泳、纯化，测序，得出样品的COⅠ基因序列，通过序列比对，发现各样品序列与数据库中序列的相似性达到99%。根据文献[11-12]对11门13 320个物种的COⅠ基因序列进行比较分析，表明所研究物种的种间平均遗传距离为11.3%，其中79%的物种间遗传距离均大于8%。本研究在线比对结果相似性为99%，差异性小于1%，可确定与数据库中为同一物种。本研究鉴定了羊角类完整样品与不完整样品的物种来源。可见，基于COⅠ基因的DNA条形码技术可用于羚羊角及其混伪品的鉴定，该技术为羊角类药材的鉴定提供了一种准确、客观的方法。

参考文献

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（收稿日期：2017-05-19 修回日期：2017-10-13）

（編辑：林 静）