蒙药复方述达格—4特征图谱初步分析
2018-10-19杜银飞嵇增云信莎莎董玉
杜银飞 嵇增云 信莎莎 董玉
摘 要 目的:分析蒙药复方述达格-4的特征图谱。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为 Agilent Extend C18,流动相为0.4%乙酸溶液-甲醇(梯度洗脱),流速为0.6 mL/min,检测波长为286 nm,柱温为30 ℃,进样量为20 μL。分别对复方述达格-4全方及各单味药体内外特征图谱进行分析和对比。结果:复方述达格-4全方体外特征图谱有47个峰;其体内特征图谱有24个峰,其中峰1、4、7~9、12、14、18~20、22、25、38~41、44、46对应的18个成分为体外直接入血成分;各单味药体内特征图谱中峰1、4、7、8、12、14、18~22、25、40、46来源于高良姜药材;峰14、18、19、22、44来源于木香药材;峰1、4、7~9、12、14、18、19、22来源于石菖蒲药材。结论:直接入血成分及代谢产物可能为复方述达格-4在体内发挥作用的有效成分;该方法可用于其特征图谱的分析。
关键词 蒙藥;复方述达格-4;特征图谱;化学成分;体内;体外
中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2018)22-3110-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.19
ABSTRACT OBJECTIVE: To analyse characteristic chromatograms of Mongolian Compound Shudage-4. METHODS: HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Extend C18 with mobile phase consisted of 0.4% acetic acid solution-methanol (gradient elution) at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelength was set at 286 nm, and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. The in vivo and in vitro characteristic chromatograms of allsquare of Compound Shudage-4 and single ingredients were analysed and compared respectively. RESULTS: Totally 47 peaks were identified from in vitro characteristic chromatograms of allsquare of Compound Shudage-4. There were 24 common peaks from in vivo characteristic chromatograms,among which 18 ingredients corresponding to common peaks 1, 4, 7-9, 12, 14, 18-20, 22, 25, 38-41, 44, 46 were direct blood components in vitro; peaks 1, 4, 7, 8, 12, 14, 18-22, 25, 40 and 46 of serum test sample were from Alpinia officinarum; peaks 14, 18, 19, 22, 44 were from Aucklandia lappa; peaks 1, 4, 7-9, 12, 14, 18, 19, 22 were from Acorus tatarinowii. CONCLUSIONS: Blood components and some metabolites may beallsquare of Compound Shudage-4. The method can be used for the analysis of characteristic chromatograons of it.
KEYWORDS Mongolian medicine; Compound Shudage-4; Characteristic chromatogram; Chemical component; in vivo; in vitro
复方是蒙医临床用药的主要形式,具有组方复杂多样的特点。阐明药效物质基础,找到适用于复杂体系的分析方法,一直是蒙药及其复方研究的关键问题[1]。除肠道用药和外用药等少数药物外,多数药物的药效物质均以血液为递质运送至作用靶点,产生相应的药理作用[2]。因此,通过分析含药血清,对血中移行成分进行检测,以确定蒙药复方中的直接作用物质,是其药效物质基础研究的有效途径之一[3]。
复方述达格-4又名菖蒲四味,由高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲4味药材按质量比4 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1组合而成,临床多用于膈肌痉挛、胸闷气短、胸肋刺痛、消化不良等症的治疗,是蒙医常用的消喘止痛传统配方。《国家卫生部药品标准·蒙药分册》[4]仅涉及复方述达格-4各味药材的鉴别与含量测定,并未收载此复方。本课题组前期对复方述达格-4的化学成分、质量控制、药理作用方面进行了大量研究[5-9],但对其特征图谱涉及较少。因此,本试验采用高效液相色谱法(HPLC)对复方述达格-4特征图谱初步分析,为其后续药动学研究提供依据。
1 材料
1.1 仪器
1260型HPLC仪,包括DEACB06007梯度泵、DEAAC21236自动进样器、DEAAX04861检测器、JPAAJ82372柱温箱、DEACN22944化学工作站(美国Agilent公司);BT25S型十万分之一电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HH-S型电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);Vortex-GENIE型微型旋涡混合仪(美国Scientific Industries公司);3-18K型低温高速离心机(美国Sigma公司);移液器(德国Eppendorf公司,规格:0.5~10、10~100、20~200 μL);BCD-272型冰箱(博西华家用电器有限公司)。
1.2 试剂
山柰酚对照品(批号:20160328,纯度:99.8%)、山柰素对照品(批号:20160812,纯度:99.8%)、高良姜素-3-甲醚对照品(批号:20170919,纯度:99.8%)均购自北京坛墨质检科技有限公司;芦丁对照品(批号:100080-201209,纯度:99.4%)、茴香酸对照品(批号:100097-199402,纯度:99.8%)、槲皮素对照品(批号:100081-200406,纯度:99.8%)、丁香酚对照品(批号:110725-201414,纯度:99.8%)均购自中国食品药品检定研究院; 1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮对照品、高良姜素对照品(内蒙古医科大学药学院生药学实验室自制,经氢谱、碳谱鉴定结构,经HPLC法检测以峰面积归一化法计算纯度均大于95%);甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为纯化水。
1.3 药材
高良姜(批号:150201)、紫硇砂(批号:170701)、木香(批号:170601)、石菖蒲(批号:171001144)药材均购自内蒙古天立药业有限公司,经内蒙古医科大学药学院李骁副教授鉴定为真品。
1.4 动物
清洁级健康Wistar大鼠36只,雄性,约2月龄,体质量250~300 g,由内蒙古医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号:SCXK(蒙)2015-0001;动物使用许可证号:SYXK(蒙)2015-0001]。标准条件饲养,自由进食、饮水,适宜温度、湿度,人工黑暗和光照交替。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.4%乙酸溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(洗脱程序见表1);流速:0.6 mL/min;检测波长:286 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。
2.2 溶液和血清的制备
2.2.1 对照品溶液 分别称取高良姜素、山柰酚、山柰素、高良姜素-3-甲醚、芦丁、茴香酸、槲皮素、丁香酚、1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮對照品各适量,分别加甲醇溶解,制成单一对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取复方述达格-4方中高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲药材(4 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1,m/m/m/m)共约20 kg,乙醇回流提取2次,合并提取液(回收溶剂),超声(功率:250 W,频率:40 kHz)处理5 min,经大孔树脂柱洗脱,洗脱液浓缩干燥得粉末(全方);各单味药按全方比例分别同法制成粉末,分别加甲醇溶解,4 ℃贮藏,备用。
2.2.3 空白血清和含药血清 36只大鼠随机分成空白对照组(等体积水)、复方述达格-4(全方)组(6.3 g/kg)、 高良姜组(6.3 g/kg)、紫硇砂组(6.3 g/kg)、木香组(6.3 g/kg)、石菖蒲组(6.3 g/kg)[8],每组6只。各给药组大鼠灌胃相应药物,空白对照组大鼠灌胃等体积水1次。大鼠给药120 min后,乙醚吸入麻醉,腹主动脉采血适量,以3 000 r/min离心10 min,取上清液,即得空白血清和各含药血清,置于-20 ℃冰箱中贮藏,备用。
2.2.4 供试血清 分别取“2.2.3”项下空白血清和各含药血清0.5 mL,分别置于10 mL离心管中,加入2 mL乙腈,涡旋1 min,以3 000 r/min离心10 min,取上清液,氮气吹干,精密加入0.15 mL水使沉淀充分溶解,经0.45 μm微孔滤膜滤过,即得。
2.3 系统适用性试验
取“2.2.1”项下单一对照品溶液各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果,理论板数以高良姜素、山柰酚、山柰素、高良姜素-3-甲醚、芦丁、茴香酸、槲皮素、丁香酚、1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮峰计均不低于3 000;基线分离良好,分离度均大于1.5。
2.4 复方述达格-4全方及各单味药体外特征图谱分析
取“2.2.2”项下供试品溶液各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,详见图1。由图1可知,复方述达格-4全方体外特征图谱显示有47个峰,其中,峰1~8、12、15~18、20、23~30、35、38~43、46来源于高良姜药材;峰2~4、6~11、13、15、16、18、19、22、24来源于木香药材;峰1~3、5、11~16、18、19、23、24、28、29、32、33、36、39、41~44来源于石菖蒲药材。经与对照品色谱图比对,确定峰10对应成分为芦丁,峰11对应成分为茴香酸,峰20对应成分为槲皮素,峰22对应成分为丁香酚,峰24对应成分为山柰酚,峰29对应成分为1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮,峰38对应成分为高良姜素,峰39对应成分为山柰素,峰40对应成分为高良姜素-3-甲醚。
2.5 复方述达格-4全方体内特征图谱分析
取“2.2.4”项下复方述达格-4全方供试血清和空白供试血清各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,详见图2。由图2可知,复方述达格-4全方体内特征图谱与图1A比对,峰1、4、7~9、12、14、18~20、22、25、38~41、44、46对应的18个成分为共同存在的成分(即体外直接入血成分),其他成分在图1A中未找到对应峰,推测为代谢产物;峰14、19、20、22、44对应的成分在血中相对含量增高(峰面积增大),而峰38~41对应的成分入血后其相对含量降低(峰面积减小)。
2.6 复方述达格-4各单味药体内特征图谱分析
取“2.2.4”项下各单味药供试血清和空白供试血清各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,详见图3。经图3与图2A对比可知,峰1、4、7、8、12、14、18~22、25、40、46来源于高良姜药材;峰14、18、19、22、44来源于木香药材;峰1、4、7~9、12、14、18、19、22来源于石菖蒲药材。经与对照品色谱图比对,确定峰20对应成分为槲皮素,峰22对应成分为丁香酚,峰24对应成分为山柰酚,峰38对应成分为高良姜素,峰39对应成分为山柰素,峰40对应成分为高良姜素-3-甲醚。
3 讨论
一般认为,生物样品中内源性杂质较多,所含成分复杂,且相关成分含量较低,为了凸显待测成分、保护色谱柱,需对生物样品进行前处理。常用的处理方法包括有机溶剂沉淀蛋白法、强酸沉淀蛋白法、重金属盐沉淀蛋白法、液液萃取法等[10]。预试验中,笔者分别考察了以乙腈或甲醇或L-抗坏血酸+乙酸乙酯处理血清的效果。结果发现,采用乙腈处理血清样品后可得较全的色谱峰,因此确定以乙腈与血清按体积比4 ∶ 1进行处理,去除蛋白质。
预试验中,笔者采用腹主动脉采血,分别考察了大鼠灌胃给药30、60、90、120、150、180 min后血清样品的HPLC图。经比较发现,大鼠灌胃给药120 min后血清样品的HPLC图色谱峰数目较多,因此确定120 min为最终采血时间点。
经复方述达格-4全方体内外特征图谱比对,发现有24个血中移行成分,其中有18个成分为体外直接入血成分,另外6个成分推测为代谢产物。其中,高良姜素、山柰素与高良姜素-3-甲醚在体外特征图谱中相对峰面积较大,但三者在体内特征图谱中相对峰面积明显减小。经分析,可能是由于高良姜素、山柰素与高良姜素-3-甲醚在体内未被充分游离或者是代谢为其他产物。本试验未检测到紫硇砂药材体内外特征图谱,是否由于色谱条件不适宜所致仍有待进一步分析。基于此,本课题组后续将对复方述达格-4全方及各单味药体内外特征图谱中相对面积较小的峰进行指认,并对有关成分体内代谢产物进行追踪,从而对复方述达格-4进行较为全面的分析。
参考文献
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(收稿日期:2018-02-25 修回日期:2018-04-06)
(编辑:张 静)