大孔吸附树脂分离纯化赤雹根总皂苷的工艺研究

2018-10-19聂佳李忠思佟继铭刘春楠刘克明刘永平

中国药房 2018年3期

聂佳　李忠思　佟继铭　刘春楠　刘克明　刘永平

中圖分类号 R284.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）03-0322-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.08

摘要目的：考察大孔吸附树脂分离纯化赤雹根总皂苷（TSTR）的工艺。方法：采用紫外-可见分光光度法测定TSTR含量。通过比较不同型号（AB-8、D101、DM130、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD826、NKA-9）大孔吸附树脂的静态吸附、解吸性能，筛选大孔吸附树脂型号；以TSTR含量为指标，考察大孔吸附树脂对TSTR吸附的影响因素（树脂径高比、药液质量浓度、吸附体积流量、饱和吸附量）、解吸的影响因素（解吸溶剂体积分数、解吸溶剂体积流量、解吸溶剂体积），筛选最优工艺条件并进行验证及TSTR的纯化制备。结果：以HPD100型大孔吸附树脂对TSTR的吸附和解吸性能较佳；吸附的最优工艺条件为树脂柱径高比 1 ∶ 5、药液质量浓度1 g/mL、吸附体积流量1 BV/h、饱和吸附量为1.25 g生药/1 g HPD100树脂；解吸的最优工艺条件为解吸溶剂乙醇体积分数75%、解吸体积流量3 BV/h、解吸溶剂体积5 BV；验证工艺中TSTR的平均解吸保留率为77.96%（RSD=0.46%，n=3），最终所制备的TSTR干膏中TSTR的纯度为52.47%（RSD=1.53%，n=3）。结论：该优选纯化工艺稳定可行，可用于TSTR的分离纯化。

关键词大孔吸附树脂；分离；纯化；赤雹根；总皂苷

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the separation and purification technology of total saponins from the root of Thladian- tha dubia （TSTR）. METHODS： The content of TSTR was determined by UV-visible spectrophotometry. By comparing static adsorption and desorption properties of different types （AB-8， D101， DM130， HPD100， HPD300， HPD450， HPD600， HPD826， NKA-9） of macroporous adsorption resin， the type of macroporous adsorption resin was screened. With the content of TSTR as the index， influential factors of macroporous adsorption resin for adsorbing （ratio of height to diameter of resin， mass concentration of medicine liquid， adsorption volume flow， saturated extent of adsorption） and desorbing （desorption solvent volume fraction， desorption solvent volume flow， volume of desorbed solvent） TSTR were investigated. The optimal technology was screened. The technology validation， purification and preparation were conducted. RESULTS： HPD100 type macroporous adsorption resin had good adsorption and desorption properties for TSTR. The optimal adsorption technology was that the ratio of the height to diameter of the resin column was 1 ∶ 5； mass concentration of medicine liquid was 1 g/mL； adsorption volume flow rate was 1 BV/h； saturated adsorption capacity was 1.25 g per 1 g HPD100 resin； the optimal desorption technology was that the volume fraction of desorption solvent ethanol was 75%； volume flow rate of desorption was 3 BV/h； the volume of desorption solvent was 5 BV. The average desorption retention rate of TSTR was 77.96% in technology validation （RSD=0.46%， n=3） and the purity of prepared TSTR in TSTR dry cream was 52.47% （RSD=1.53%， n=3）. CONCLUSIONS： The optimal purification technology is stable， feasible and suitable for the separation and purification of TSTR.

KEYWORDS Macroporous adsorption resin； Separation； Purification； Root of Thladiantha dubia； Total saponins

赤雹根为葫芦科多年蔓生草本植物赤雹（Thladiantha dubia Bunge）的干燥成熟块根，味苦性寒，具有活血祛瘀、清热解毒、通乳等作用，满族民间常用于治疗风湿痹痛、腰腿痛、痛经及软组织损伤等[1]。前期研究结果证实赤雹根镇痛作用的主要有效部位为赤雹根总皂苷（TSTR）[1-2]，且TSTR对佐剂关节炎大鼠有较好的治疗作用，并能抑制炎症因子的表达，延缓滑膜病变的发生和发展[3-5]。目前对于皂苷类成分的提取有多种方法，其中树脂吸附法有可选择性吸附、容易再生、可重复使用等优点，已广泛应用于皂苷类成分的分离和富集。因此，本研究选择9种树脂进行吸附、解吸试验，最终确立TSTR分离纯化的最优工艺条件，为TSTR后续的开发和利用提供一定的试验基础。

1 材料

1.1 仪器

HP-8453型紫外-可见分光光度仪（美国惠普公司）；GL-20B型冷冻离心仪（上海安亭科学仪器厂）；GT16-3型高速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；YP1200型电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；AG245型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；电热恒温水浴锅（上海东星建材试验设备有限公司）。

1.2 药材、药品、树脂与试剂

赤雹根药材（2013年10月采集于河北省青龙满族自治县，经承德医学院中药研究所赵春颖教授鉴定，确认为葫芦科植物赤雹的成熟干燥块根）；齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110709-201206，纯度：99.7%）；大孔吸附树脂AB-8、D101、DM130、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD826、NKA-9（沧州宝恩吸附材料科技有限公司，批号：20160309、20160419、20160309、20160422、20160420、20151125、20160325、20151225、20160419）；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 紫外-可见分光光度法测定TSTR含量

TSTR样品溶液的含量测定方法依据本实验室前期建立的紫外-可见分光光法[6]。

2.1.1 TSTR样品溶液的制备取赤雹根药材适量，置于圆底烧瓶中并加入70%乙醇浸泡过夜，在80 ℃下回流提取3次，每次1 h。合并3次所得提取液，抽滤，然后将滤液置于圆底烧瓶中，减压浓缩，将浓缩液于烘箱中80 ℃烘干，得TSTR干膏，备用。加入适量水将所得干膏溶解即得TSTR样品溶液（所含生药质量浓度为1 g/mL）[6]。

2.1.2 方法学考察根据相应要求进行方法学考察[6]。以吸光度值为纵坐标（y），对照品质量浓度为横坐标（x，μg/mL）进行线性回归，得回归方程y=0.055 9x-0.027 1（r=0.999 7），TSTR在质量浓度为3.13～39.41 μg/mL范围线性关系良好。精密度试验中RSD=0.67%（n=6），1.5 h内稳定性试验中RSD=2.91%（n=6），重复性试验中RSD=2.78%（n=6），平均加样回收率为98.9%（RSD=1.99%，n=6），均符合相关要求。

2.1.3 样品含量测定准确移取“2.1.1”项下TSTR样品溶液1 mL置于10 mL EP管中，在545 nm波长处测定吸光度值。经计算干膏中TSTR纯度为30.92%。

2.2 大孔吸附树脂型号的筛选

2.2.1 大孔吸附树脂的类型选择根据TSTR的理化性质以及大孔吸附树脂的吸附性能，选用AB-8、D101、DM130、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD826、NKA-9共9种型号的大孔吸附树脂进行试验。将上述9种树脂分别用95%乙醇浸泡过夜，除去上层乙醇，湿法装柱，用95%乙醇先以2 BV/h的流速洗至流出液加3 BV纯水不再产生浑浊为止，然后用水洗至流出液无醇味，备用。

2.2.2 静态吸附、解吸性能比较精密称取预处理后的9种大孔吸附树脂各5 g，精密加入稀释至0.95 mg/mL（以生药计）TSTR样品溶液23 mL，每10 min振摇1次（每次持续1 min），连续2 h，然后静置24 h，过滤，收集吸附后滤液，测定每份滤液的吸光度，代入回归方程得出滤液中TSTR的质量浓度，然后计算每份的比吸附量和吸附率。分别将过滤后的树脂重新分别置于9只锥形瓶内，依次准确加入20 mL 70%乙醇，每10 min振摇1次（持续1 min），连续2 h，静置8 h后，过滤，测定滤液中TSTR的质量浓度，并计算其比解吸量和解吸率。设定吸附前药液中总皂苷质量为m1、流出液中总皂苷质量m2、解吸液中总皂苷质量为m3、湿树脂量为m4，则比吸附量=（m1-m2）/m4；吸附率=（m1-m2）/m1×100%；比解吸量=m3/m4；解吸率=m3/（m1-m2）。9种大孔吸附树脂对TSTR的吸附、解吸性能见表1。

由表1可知，HPD100与HPD826的比解吸量分别为30.36、33.58 mg/g，均高于其他7种型号的树脂，其中HPD100的比吸附量和吸附率分别为50.68 mg/g、52.84%，HPD100的比吸附量和吸附率均高于其余8种型号的树脂。故采用HPD100型大孔吸附樹脂纯化富集TSTR。

2.3 HPD100型大孔吸附树脂对TSTR吸附的影响因素考察

2.3.1 树脂径高比、药液质量浓度及吸附体积流量根据预试验，以溶液中的TSTR质量为考察指标，选择对HPD100型大孔吸附树脂吸附TSTR可能产生影响的树脂柱径高比、药液质量浓度（以生药计）、吸附体积流量为考察因素设计正交试验，各组均取“2.1.1”项下TSTR样品溶液3 mL。正交试验因素与水平见表2，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

由表3、表4可知，各因素对试验结果的影响程度依次为B>A>C，其中因素B对试验结果具有显著影响（P<0.05）。由此确定最佳组合为A2B3C2，由于因素C对试验结果的影响最小，出于降低成本的要求，确定最终最佳水平组合为A2B3C1，即树脂柱径高比为1 ∶ 5，药液质量浓度为1.0 g/mL，吸附体积流量为1 BV/h。

2.3.2 饱和吸附量的确定取20 g HPD100型大孔吸附树脂，经预处理后湿法装柱，备用。准确移取“2.1.1”项下1.0 g/mL（以生药计）TSTR样品溶液100 mL，在树脂柱径高比为1 ∶ 5，药液质量浓度为1.0 g/mL，吸附体积流量为1 BV/h条件下装柱、上样，每5 mL作为1个流分，等体积收集16份。按“2.1”项下方法操作并计算每一流分中TSTR的质量，以收集的流分序号为横坐标，以TSTR的质量为纵坐标，并绘制泄漏曲线，结果见图1。

由图1可知，从流分6开始树脂柱出现明显的泄露现象，流分6中TSTR的质量是流分5中的3.3倍，故20 g HPD100型大孔树脂吸附上样液的最大体积为25 mL，即相当于25 g生药，因此，可推知HPD100型大孔树脂的饱和吸附量为每1 g树脂可吸附1.25 g生药。

2.4 HPD100型大孔树脂对TSTR解吸附的影响因素考察

2.4.1 解吸溶剂体积分数的考察取40 g预处理后的HPD100型大孔树脂，湿法装柱。量取50 mL质量浓度为1.0 g/mL（以生药计）的TSTR样品溶液，以1 BV/h的流速通过树脂柱，先用纯水洗至Molish反应为阴性，然后依次用1 BV体积分数为15%、30%、45%、60%、75%、90%乙醇，以3 BV/h的流速洗脱，每21 mL作为1个流分，等体积收集18份。从每个流分中精密移取1 mL置于10 mL EP管中，按“2.1”项下方法操作并计算每一流分中TSTR的质量，以收集的流分序号为横坐标，以TSTR的质量为纵坐标，并绘制洗脱曲线，结果见图2。

由图2可知，TSTR主要集中在60%～75%乙醇洗脱液中，总量占全部乙醇洗脱液中TSTR质量的66.54%。由于75%乙醇具有良好的洗脱能力，而90%乙醇洗脱液中TSTR含量偏低，仅占TSTR总量的7.97%，从经济成本考虑，洗脱时先用纯水洗去糖类等极性大的杂质，再用30%乙醇溶液洗去极性较大的杂质，最后用75%乙醇溶液洗脱TSTR。

2.4.2 解吸溶剂体积流量的考察按照以上优化条件装4根HPD100型大孔吸附树脂柱，准确量取4份等体积质量浓度为1.0 g/mL（以生药计）的上样液，以1 BV/h的流速通过树脂柱，先用5.5 BV的纯水洗脱至Molish反应为阴性。然后分别用8 BV的75%乙醇以1、2、3、4 BV/h的解吸体积流量进行洗脱，收集洗脱液，每份精密移取1 mL置于10 mL EP管中，按照“2.1”项下方法操作并计算每一流分中TSTR的质量，结果，当解吸体积流量分别为1、2、3、4 BV/h时，TSTR质量分别为106.31、106.73、109.66、106.99 mg。

当解吸体积流量为3 BV/h时，洗脱液中TSTR质量最大为109.66 mg，解吸体积流量從1～3 BV/h时，所得到TSTR的质量与解吸体积流量的大小呈正相关关系，解吸体积流量增大至4 BV/h时，所得到TSTR的质量开始下降，所以最佳的解吸体积流量为3 BV/h。

2.4.3 解吸溶剂体积的考察精密量取13 mL质量浓度为1.0 g/mL（以生药计）的上样液，按照以上优化条件进行试验，吸附完全后，先用5.5 BV的纯水洗至Molish反应为阴性，然后用75%乙醇以3 BV/h的流速进行洗脱，流出液每流出1 BV时精确移取1 mL于10 mL EP管中，连续取样7次，按照“2.1”项下方法操作并计算每一流分（解吸溶剂体积为1、2、3、4、5、6、7 BV时）中TSTR的质量，结果见图3。

由图3可知，当解吸溶剂体积为7 BV时流出液中TSTR的质量是最大的，从5～7 BV解吸曲线增高趋势变缓，最终所得TSTR的质量相差不大，从经济成本上考虑，解吸时解吸溶剂的体积为5 BV时较佳。

2.5 工艺验证试验

配制质量浓度为1.0 g/mL（以生药计）的TSTR样品溶液30 mL，取3根树脂柱用HPD100型大孔树脂湿法装柱，经预处理后，各取10 mL样品溶液过树脂柱，树脂柱径高比为1 ∶ 5，药液质量浓度为1.0 g/mL，吸附体积流量为1 BV/h条件进行吸附，5.5 BV纯水洗去极性较大的杂质，然后再用5 BV的75%乙醇溶液洗脱，分别收集乙醇洗脱液。按“2.1”项下方法操作并计算每一份洗脱液中TSTR的质量并计算解吸保留率（洗脱后TSTR的质量/吸附量×100%），结果见表5。

表5 TSTR的解吸保留率计算结果（n=3）

Tab 5 Results of desorption retention of TSTR（n=3）

[编号样品溶液中TSTR

的质量，mg 吸附量，

mg 洗脱后TSTR

的质量，mg 解吸保留

率，% 平均解吸保

留率，% RSD，

% 1 237.30 135.74 106.24 78.27 2 237.30 135.74 105.30 77.57 77.96 0.46 3 237.30 135.74 105.93 78.04 ]

前期试验证实，10 mL（含生药1.0 mg/mL）的上样液过径高比1 ∶ 5的HPD100型大孔树脂柱的解析保留率为57.20% 。由表5可知，当上样液为10 mL时，TSTR的平均解吸保留率为77.96%（RSD=0.46%，n=3），说明用HPD100型大孔树脂富集纯化TSTR的最优工艺稳定可行。

2.6 TSTR的制备

取赤雹根生药材700 g（即生药量为700 g），按“2.1.1”项下方法制备TSTR干膏，按照树脂柱径高比为1 ∶ 5，药液质量浓度为1.0 g/mL，吸附体积流量为1 BV/h纯化工艺装柱、上样，依次用5.5 BV纯水、4 BV 30%乙醇、5 BV 75%乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩，浓缩液于80 ℃烘箱中烘干，并测定其中TSTR的纯度，结果见表6。

由表6可知，所制备的TSTR干膏中TSTR的纯度为52.47%（RSD=1.53%，n=3），纯度大于50%，说明采用本法富集、纯化TSTR的工艺合理、可行。

3 讨论

大孔树脂为一类新型非离子型高分子化合物，能够选择性吸附有机物，具有吸附容量大、解吸速度快、洗脱率高、再生容易等优点[7-10]。已有研究发现，用大孔吸附树脂富集、纯化玉竹、人参、木瓜、黄芪等总皂苷效果较为理想[11-14]。目前已广泛应用于天然药物的分离与富集，尤其适用于水溶性化合物，如皂苷、黄酮等成分。

树脂径高比、药液质量浓度及吸附体积流量，这三者可以直接影响大孔吸附树脂的吸附性能。合理的径高比可以提高树脂对植物有效成分的吸附与分离。对于药液质量浓度，若药液质量浓度过高，则黏度较大，被吸附的物质往树脂内部扩散传质速度变慢，杂质与有效成分或有效成分之间产生竞争吸附，易导致树脂过饱和；若药液质量浓度过低，则黏度较小，在一定上样流速下溶液通过柱床流速较快，大于传质速度，传质未进行彻底即可能泄露[15]。对于吸附体积流量，若流量过快时，可能会导致树脂对样品有效成分吸附不充分，从而造成样品有效成分的泄露；流量过慢时，吸附速率会下降，时间消耗增加，使生产周期延长，成本提高。因此，本试验考察树脂径高比、药液质量浓度及吸附体积流量这3种因素的不同水平对结果的影响，得出3因素的最优水平组合为树脂柱径高比为1 ∶ 5，药液质量浓度为1.0 g/mL（以生药计），吸附体积流量为1 BV/h。

赤雹根的主要成分为三萜皂苷类成分，迄今为止已经从赤雹根中分离并鉴定出多个皂苷类成分，主要为齐墩果酸类化合物。本试验对9种具有极性、非极性及弱极性的大孔吸附树脂对TSTR的吸附、解吸性能进行了考察，确定了HPD100型大孔吸附树脂分离纯化TSTR的效果比较理想，通过梯度洗脱，先采用低浓度30%乙醇溶液洗去极性较大的杂质，然后再用75%乙醇溶液洗脱获得纯度为52.47%的TSTR。由于30%乙醇洗脱液中含有一定量的皂苷，故将30%乙醇洗脱液收集，浓缩，80 ℃烘干后得到干膏，用于进一步的分离纯化研究。从结果上分析，TSTR的含量由原来的干膏中的30.92%提高到洗脱物中的52.47%，纯化工艺稳定可行。

综上分析，HPD100型大孔吸附树脂对TSTR具有良好的纯化性能，且工艺条件稳定，可为TSTR的工业化生产提供理论参考，同时也为TSTR类物质的分离、鉴定及其应用研究提供了依据。

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