大孔树脂富集纯化阿夏塞尔郡总黄酮的工艺研究*

泽仁达瓦 林朝展

（1.西藏藏医学院科研处，西藏 拉萨 850002；2.广州中医药大学临床药理研究所，广东 广州 510405）

藏药“阿夏塞尔郡”又名打箭菊，为菊科匹菊属植物川西小黄菊 Pyrethrum tatsienense（Bur.et Franch.）Ling的干燥地上部分［1］。性寒，味苦，无毒。具有活血、散癖、祛湿、消炎、止痛功能。文献报道打箭菊中主要含有木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、洋芹素、芫花素等黄酮类成分［2］。大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂，具有高选择性、高机械强度、高稳定性、大载样量、以及再生处理简便等优点［3］，在医药领域（特别是天然药物纯化）中广为应用，是分离纯化中药有效成分的一种常用方法［4］。其中AB-8大孔树脂属于快速吸附树脂，吸附量和解吸率都较高，是理想的适用于中药总黄酮吸附分离的树脂类型［5-7］。此实验旨在探讨AB-8型大孔树脂富集阿夏塞尔郡总黄酮的工艺流程与参数，同时建立阿夏塞尔郡总黄酮相应的质控标准。

1 仪器、材料和试剂

1.1 仪器

HEWLETT PACKARD-6010紫外-可见分光光度计（美国Agilent公司），Satorius QUINTIX65-1CN十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 材料

阿夏塞尔郡样品，2014年6月采自西藏林芝地区，经西藏藏医学院康萨·索朗其美教授鉴定学名为菊科匹菊属植物川西小黄菊Pyrethrum tatsienense（Bur.et Franch）Ling，凭证标本（PT-201406）现保存于广州中医药大学临床药理研究所。AB-8型大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂），芦丁对照品，其结构经IR、MS和NMR波谱鉴定，纯度经HPLC面积归一化法计算均在98%以上，均为此实验自制。

1.3 试剂

冰醋酸、乙醇，均为AR级。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的制备

取芦丁5.0 mg，精密称定，置20mL容量瓶中，加乙醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液（0.286mg/mL）。精密量取芦丁对照品溶液0.1，0.4，0.8，1.2，2.0，3.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加乙醇至6mL，再加0.5mL 2%三氯化铝乙醇溶液（含1%冰醋酸），加乙醇至刻度，摇匀，放置1 h，以乙醇为空白对照，在275 nm下测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标（y），浓度为横坐标（x），绘制标准曲线图，并得到回归方程：y=0.0341x+0.0023(r=0.9997），线性范围：1.14-34.32 μg/mL。

2.2 供试品溶液的制备

取打箭菊药材粉末约20 g，精密称定，分别加入20倍量、15倍量80%乙醇，加热回流提取2次，合并2次提取液，减压浓缩，挥干，用乙醇适量溶解，过滤，滤液定容至100mL，即得。测定总黄酮含量（紫外分光光度法：取1mL打箭菊供试品溶液，各加乙醇至6mL，再加0.5 mL 2%三氯化铝乙醇溶液（含1%冰醋酸），用乙醇稀释定容至25mL，摇匀，放置60min，在275nm下测定吸光度，测得结果见表1，随行标曲为y=0.031x+0.048(r=1)。

表1 打箭菊中总黄酮的含量

2.3 大孔树脂工艺参数考察

2.3.1 大孔树脂预处理与装柱。称取AB-8大孔树脂7 kg（湿重），用95%乙醇浸泡12小时，湿法装柱（d=15cm，h=52cm，V=9 L）。然后用95%乙醇洗脱杂质，控制流速为2 mL/min，洗至1 mL洗脱液与3 mL蒸馏水混合不出现白色混浊为止，再用蒸馏水平衡柱子，至树脂排列均匀、无气泡、洗脱液无醇味时即可。

2.3.2 吸附容量的确定。吸取上述提取液50 mL，挥干，用蒸馏水适量溶解成混悬液，湿法上样于大孔树脂柱（10 g湿法装柱于10 mm×50 mm柱中，柱体积BV=15 mL）。收集过柱液，平行3份，测定其中总黄酮含量，过柱液反复上柱，直到其吸光度值不再变化，测定最后一次收集的过柱液中总黄酮含量。上样液中总黄酮含量=上样液中总黄酮的量/上样液干膏重。

表2 吸附容量的确定*

2.3.3 乙醇浓度的确定。取样品液50 mL，按“2.3.2”项上柱后，先用蒸馏水洗脱10个柱体积，分别再用30%乙醇和70%乙醇各10个柱体积洗脱，洗脱液流速为1.5 mL/min-1，每10 mL收集一个流份，依次编号为1、2、3…36。精密吸取1 mL打箭菊供试品溶液，各加乙醇至6 mL，再加0.5 mL 2%三氯化铝乙醇溶液（含1%冰醋酸），用乙醇稀释定容至25 mL，摇匀，放置60 min，在275 nm下测定吸光度。以流份编号为横坐标（X），以总黄酮含量为纵坐标（Y）绘制洗脱曲线。分别收集蒸馏水洗脱液、30%乙醇洗脱液、70%乙醇洗脱液，进行减压浓缩、干燥，称其干膏重，计算打箭菊总黄酮的含量，见表3。

表3 打箭菊总黄酮在不同洗脱液中的含量

从上表中可看出，蒸馏水洗脱出来的总黄酮为34.84 mg，其干膏中总黄酮含量占11.85%；30%的乙醇洗脱出来的总黄酮为84.95 mg，其干膏中总黄酮含量占66.38%；70%乙醇洗脱的总黄酮为40.94 mg，其干膏中总黄酮含量占14.15%.其中70%乙醇洗脱液干膏重比30%的乙醇洗脱液干膏重多，但总黄酮含量较少，因此30%的乙醇洗脱效果优于70%乙醇洗脱效果。

2.3.4 洗脱剂的确定。由表4的数据可知，当30%乙醇洗脱到第18号接收瓶，即洗脱12个柱体积时，总黄酮基本洗脱出来，故确定溶媒用量为180 mL，约为12个柱体积。

表4 30%乙醇的洗脱曲线表

2.3.5 重复验证试验。根据上述实验结果，按最优化条件，精密吸取打箭菊样品液20 mL上柱，依次用12个柱体积的蒸馏水和12个柱体积30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，平行3份，测定30%乙醇洗脱液中总黄酮含量，另取20 mL打箭菊上柱样品液与30%乙醇洗脱液分别水浴挥干，烘箱恒重，计算总固物，结果见表5。

表5 重复验证试验结果（n=3）

3 讨论

此课题组前期从打箭菊的甲醇提取物中分离并鉴定出14个黄酮类化合物［1］，表明黄酮类化合物是打箭菊的主要成分类群，因此，摸索出稳定可靠的打箭菊总黄酮提取精制工艺，为后续研究提供有力支撑。

此实验采用AB-8型大孔树脂研究精制、纯化打箭菊总黄酮的工艺条件及参数。以打箭菊总黄酮洗脱率和含量为考察指标，对大孔树脂的吸附容量、洗脱剂的乙醇浓度、洗脱剂量进行考察。结果为AB-8型大孔树脂对打箭菊总黄酮的吸附容量为18.02 mg/g树脂；以30%乙醇为洗脱剂效果最佳；洗脱剂用量为180mL约12个柱体积。用30%乙醇为洗脱剂进行洗脱，可使打箭菊总黄酮的精制度达到500%以上，30%乙醇洗脱液中总固物中总黄酮含量达62.4%以上，与纯化前相比明显提高，富集效果较好，该工艺操作简单，重复性好，可作为打箭菊总黄酮有效的富集方法，在中药有效成分分离、富集工艺中有一定的推广价值。