石油对中华绒螯蟹抗氧化酶活性的影响

蔺翠翠，郑怀东，刘学光，关 丽，闻福安，郭欣硕

（1.辽宁省水产品质量安全检验检测局，辽宁 沈阳 110000；2.沈阳市动物卫生监督所，辽宁 沈阳 110000）

石油是含有多种物质的复杂混合物，其中包括多种毒性大且具有“三致”效应的有机物质，如苯系化合物、多环芳烃（PHAs）等，因此它对生态环境具有极其严重的危害潜能，被许多国家纳入危险物质清单。美国国家环境保护局（USEPA）在1979年公布的129种优先控制污染物名单中就己包含了16种PAHs。我国水中优先控制的68种污染物黑名单中PAHs也在其列。石油通过各种途径进入生态环境后，对环境、植物、生物体乃至人类将产生持久性损害。酶是生物体用来维持机体正常新陈代谢的重要生物大分子，所有的生命活动都离不开酶的正常运行。酶活性被认为是一种能够快速而灵敏地反映环境胁迫对生物体影响的生化指标。石油进入生物体后，通过诱导可产生大量的ROS攻击酶致使酶失活，同时还将与机体的抗氧化酶系统直接发生作用，导致酶的表达和活性都发生变化。细胞中存在大型的抗氧化防御系统能够及时清除ROS，抗氧化酶是清除ROS的第一道防线。

中华绒螯蟹广泛分布于我国东部沿海、湖泊河流，是一重要的传统经济蟹类。是我国出口优势水产品之一，其肉质鲜美，是广受喜爱的食用水产品。鳃是河蟹的呼吸器官，同时承担着调节渗透压和离子平衡的作用；肝胰腺是河蟹重要的解毒器官，在降低或消除外来有毒物质毒害影响方面起着重要作用。本课题组在前期研究中发现，石油在河蟹体内的积累具有明显的组织差异性，肝胰腺和腮的积累量较高，是急性毒性的主要靶点，并且能够造成组织器官的显微结构变化。许多学者已将抗氧化酶作为生物体氧化胁迫的和损伤的标志物，因此，本文就不同浓度的石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮组织细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）酶活性的影响进行了研究，旨在探明石油对抗氧化酶系统的毒性影响程度与致毒机制，为水产品的安全养殖提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验动物：中华绒螯蟹由盘锦光合蟹业有限公司提供，雌雄随机，平均体重51.2±0.35克，实验中饲养水采用盐度为3‰的人工海水模拟生活环境。暂养5天后选择大小适中、活力强的中华绒螯蟹作为实验用蟹。

石油烃母液：1升烧杯中加入0号柴油和实验用水，体积比约为1∶1，磁力搅拌器搅拌24小时，放置分层，虹吸下层溶液作为实验用母液。

实验仪器：电动匀浆机（IKA TIGITAL）、均质器（IKA T10B）、双光束紫外分光光度计（北京普析通用U V-1800）、低温冷冻离心机（日本C F16R XⅡ）、数显恒温水浴锅（爱朗2000）、电子天平（Sartorius，BT25S）、低温冷冻离心机（日本CF16RXⅡ）。

1.2 实验设计

采用急性毒性实验方法，由概率单位法计算得出石油对中华绒螯蟹的96小时半致死浓度（LD50）；根据LD50浓度设计3个实验组，分别为低浓度组：6毫克/升、中浓度组：11毫克/升、高浓度组：22.5毫克/升，同时设对照组，每组设3个平行；随机选取大小基本一致的15只中华绒螯蟹（雌雄分开）放入塑料养殖箱（42厘米×31厘米×26厘米），加入4升含有不同浓度受试物的养殖水，并用薄膜封口，以保证实验组浓度恒定。染毒时间为96小时，实验期间每天投喂成蟹饲料，下午投饵前吸净残饵，更换饲养用水，确保试验组浓度稳定，实验期间及时清理死亡个体。

1.3 实验方法

样品处理：实验结束后，各组随机选取3只中华绒螯蟹，迅速解剖，取出肝胰腺和腮，先用预冷生理盐水清洗、滤纸吸干表面水分，称重后按重量（克）∶体积（毫升）=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水，玻璃匀浆器冰浴匀浆，匀浆液4℃匀浆10分钟，2500转/分离心10分钟，上清液-20℃保存，一周内测定酶活性。

酶活测定：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）活力测定具体操作步骤按照南京建成提供的试剂盒使用说明进行操作，酶活性单位采用单位/毫克蛋白。总蛋白浓度采用Bradford法进行测定，采用南京建成蛋白定量测试盒。

1.4 数据统计

所有实验结果用平均值±标准差（Mean±SD）表示，SPSS18.0软件进行统计分析，检验数据正态分布性，单因素方差分析（ANOVA），Duncan法进行多重比较，差异显着临界值为0.01。

2 结果

2.1 石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮SOD酶活性的影响

不同浓度石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮的SOD酶活性影响见图1。石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮的SOD酶活的影响总体呈现出先升高再降低的趋势。肝胰腺对照组SOD酶活为84单位/毫克蛋白，低浓度组酶活为153单位/毫克蛋白，较对照组有显著的升高（P＜0.01），中高浓度组酶活分别降至116和68单位/毫克蛋白，显著低于对照组（P＜0.01）。腮对照组酶活为149单位/毫克蛋白，酶活最高值为低浓度组的220单位/毫克蛋白，显著高于对照组（P＜0.01），最低值为高浓度组的111单位/毫克蛋白，低于对照组的50%。

图1 石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮SOD酶活性的影响

2.2 石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活性的影响

不同浓度石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮的CAT酶活性影响见图2。石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活的影响呈现出低—高—低的变化趋势，肝胰腺对照组CAT酶活为2.8单位/毫克蛋白，低浓度组酶活为2.2单位/毫克蛋白，显著低于对照组（P＜0.01），中浓度组酶活升至6.9单位/毫克蛋白，而高浓度处理CAT酶活又降至4.1单位/毫克蛋白。腮对照组CAT酶活为2.2单位/毫克蛋白，与肝胰腺CAT活力变化趋势类似，腮CAT酶活性最高值出现在中浓度处理组为8.4单位/毫克蛋白，显著高于对照组（P＜0.01）。最低值则出现在低浓度处理组为1.6单位/毫克蛋白。

图2 石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活性的影响

2.3 石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮GST酶活性的影响

不同浓度石油对中华绒螯蟹的肝胰腺和腮GST酶活影响见图3。石油对中华绒螯蟹肝胰腺GST酶活影响先降后升的变化趋势，肝胰腺低浓度组酶活性为80单位/毫克蛋白，显著低于对照组（P＜0.01），中、高浓度组肝胰腺酶活分别为117单位/毫克蛋白和132单位/毫克蛋白，与对照组差异极显著（P＜0.01）。腮GST变化趋势为低-高-低，GST酶活性最高值出现在中浓度组为196单位/毫克蛋白，而最低值则为高浓度组的132单位/毫克蛋白，均与对照组差异显著（P＜0.01）。

图3 石油对中华绒螯蟹肝胰腺和腮GST酶活的影响

3 讨论

甲壳动物等无脊椎动物体内缺乏特异性免疫机制，而主要依靠血细胞吞噬，作用抵御外界污染胁迫，血细胞在吞噬外援异物过程中会释放活性氧。在正常条件下，生物体内氧自由基的产生和清除处于一种动态平衡中，生理浓度的氧自由基不但不会危害生物体，反而能起到一些独特的生理作用。对甲壳动物来说，它可以参与细胞的分裂生长、吞噬细胞的吞噬作用和受精膜的形成。但石油的存在将打破这种平衡，使甲壳动物产生大量氧自由基，造成对机体内生物大分子如脂类、蛋白质的氧化破坏，引起细胞损伤，从而使其丧失功能。甲壳动物清除体内氧自由基主要通过抗氧化系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、过氧化氢酶（CAT）等多种活性酶完成。因此，抗氧化酶活性也是衡量机体过氧化程度的重要指标，通过监测这些指示性抗氧化酶的活力可以间接反映甲壳动物体内氧自由基含量，显示出机体受威胁程度。

SOD专一催化超氧阴离子，将之歧化为H2O2和O2，H2O2可被CAT和se-GPx进一步分解为H2O和O2，从而阻止超氧阴离子转化为活性更高的-OH。在本实验研究中，低剂量组的SOD酶活表现出激活状态，这与余群、张景飞等人的研究结果一致，分析这种激活由细胞内氧自由基被石油大量诱导而产生。中高剂量组肝胰腺和腮的SOD活性被抑制，这与石油长期胁迫从而使中华绒螯蟹机体富集过多的氧自由基有关，过多的活性氧对中华绒螯蟹体内的各种生物大分子，如脂类和蛋白质等产生氧化性的破坏作用，从而引起细胞损伤，进而使其丧失生理功能，对机体造成不可逆损伤。

CAT是一种含有Fe的金属酶，能够将SOD催化产生的H2O2分解为H2O和O2，当受到较低浓度石油胁迫时，SOD活力的上升会导致体内H2O2和羟自由基(-HO)含量的增加，如不及时清除，则会对机体造成更大的氧化损伤。此时，肝胰腺中CAT合成被激活，酶活性上升，起到了清除过量H2O2以保护机体的作用。本实验表明，石油对中华绒螯蟹CAT活性的影响在低剂量抑制过后，中剂量表现出对CAT的激活作用，这与SOD、CAT在功能上的相关性有关，在中剂量组石油的长期胁迫下，中华绒螯蟹肝胰腺和腮SOD活力开始受到抑制，此时O-2的大量增加可诱导CAT活力的升高，从而消除机体的过氧化。

GST是一类多功能的解毒酶。特定的GST亚基对致癌性环氧化物和农药等异生物质有特异的高催化活性，使之与GSH结合成低毒易排泄的化合物，属机体11相代谢酶。同时GST也具有GPx活性，GST的多功能性使得它在机体的解毒代谢中有十分重要的作用。本实验结果表明，低浓度组GST活力受到抑制，由于SOD活力的上升加快对氧自由基的清除，遏制了GST的活性。中高浓度组肝胰腺和腮的GST活力都被显著诱导，表现出较强的敏感性和诱导性，即使腮高浓度组GST活力开始下降，但活力仍超过对照组，说明中华绒螯蟹GST在石油烃的解毒过程中有重要作用。而高浓度组腮GST活力的下降与脂质过氧化和生物大分子损伤的持续增加有关，说明此时GST活性下降是自由基的毒性作用所致。GST活性下降的原因有可能是作为底物的GSH被大量消耗，同时解毒过程中产生的大量中间代谢物有可能改变GST亚基的组成降低GST活性。

4 结论

石油能够影响中华绒螯蟹的抗氧化系统酶活性，酶活性的变化是中华绒螯蟹对石油危害的一种防御反应。中华绒螯蟹抗氧化酶活性随石油污染物胁迫的时间和浓度发生规律性变化，对SOD和GST酶活影响的规律是先升高再降低，对CAT酶活的影响规律为低—高—低。本实验结果表明中华绒螯蟹的抗氧化系统对石油具有较高的敏感性，其抗氧化系统中SOD、CAT、GST等对解除石油造成的机体过氧化毒性方面具有重要作用。