Mcl⁃1表达信号通路阻断剂在H37Ra感染的小鼠模型中的作用

王新敏 王小芳 卢洋 杨菩 韩玲 王英姿 张万江 章乐

石河子大学医学院1第一附属医院泌尿外科，2病理生理学教研室（新疆石河子 832002）

1 材料与方法

1.1 菌株、实验动物和阻断剂本研究所用菌株为结核分枝杆菌国际标准减毒株H37Ra，由中国药物生物制品检定所提供并保存。实验所用小鼠为6～8周龄的SPF级（无特定病原体动物）健康雌性BALB/c小鼠，体质量约（18±2）g，购买于石河子大学实验动物中心。阻断剂AG490、PD98059和LY294002购自于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组将实验小鼠分为H37Ra感染组、阻断剂+H37Ra感染组（AG490+H37Ra感染组、PD98059+H37Ra感染组、LY294002+H37Ra感染组）和对照组，阻断剂注射剂量为100 μg/只（实验组前期筛选），同时设阻断剂处理后的1、3、5、7 d 4个时间点，每组每个时间点各设10只小鼠，以阻断剂处理时作为零时[5]。

1.2.2 构建结核分枝杆菌感染小鼠模型在生物安全柜内，用苏通培养液与生理盐水的混合物（0.5 mL；体积比为3∶1）稀释细菌，取100 μL细菌稀释液涂抹在改良罗氏培养基上。大约2～3周后，取生长状态良好的菌落，加入少量含有0.05%Tween⁃80的生理盐水，于磨菌器中充分研磨成均匀浑浊的菌悬液。将其浓度调整至1.0×107CFU/mL后，抽取0.3 mL腹腔注射到各组小鼠体内[6]。在上述时间点将各阻断剂经腹腔注入各组小鼠体内。

1.2.3 小鼠腹腔巨噬细胞的收集与提取于上述不同的时间点脱颈处死各组小鼠，将其处理至腹膜完全暴露后，向小鼠腹腔中注入5 mL RPMI⁃1640培养基，按摩腹部约10 min，反复抽吸数次（避开肠和脂肪），收集所有腹腔液。经1 200 r/min离心5 min后，弃上清，PBS液洗涤1次，加入DMEM培养液（含10%胎牛血清）将细胞重悬。最终，将收集处理好的细胞接种到6孔细胞培养板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养6 h，显微镜下观察，贴壁细胞即为小鼠腹腔巨噬细胞[6]。

1.2.4 TUNEL技术检测细胞凋亡在室温下，将上述不同时间提取并培养的小鼠腹腔巨噬细胞固定于4%的多聚甲醛（pH 7.4）上，固定约15 min。PBS冲洗3次，每次5 min后，加入0.1%Triton X⁃100于冰上裂解细胞约8 min，PBS再次冲洗3次，每次5 min。按照TUNEL试剂盒说明书的步骤操作，凋亡的细胞被TUNEL反应混合物标记出来，TUNEL阳性细胞的数量通过显微镜观察。

1.2.5 结核分枝杆菌菌落计数（CFU）将收集并提取的小鼠腹腔液经6 000 r/min离心20 min，去上清后，加入1 mL 1%Triton X⁃100裂解液，约10 min后加入1 mL DMEM培养基（含10%胎牛血清）终止裂解。将其振荡混匀约5 min后，分别进行10-2、10-3和10-4倍稀释，最终接种于罗氏培养基上。每个稀释浓度涂抹3个平板，分别置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，21 d后对其进行菌落计数。

1.2.6 细胞免疫化学检测Mcl⁃1的表达将上述各组小鼠腹腔巨噬细胞制成细胞涂片，于4℃4%的多聚甲醛中过夜。PBS洗涂片两次后，10%的胎牛血清中放置30 min，于4℃抗体孵育过夜。所用一抗为兔抗鼠 Mcl⁃1，浓度为 1∶1 000；二抗为PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物，浓度为1∶200。最终，用苏木素和伊红（H&E）清洗和复染后，由2位病理学家对其进行免疫组织化学分析，Mcl⁃1表达的亚细胞位置（细胞核和胞质）被记录在400×放大的显微镜中，并用Mcl⁃1阳性巨噬细胞的百分比表示，标准参照文献[7]。

1.2.7 HE染色观察小鼠脏器的变化在上述不同时间处死小鼠后，立即将其肺、肝、脾、肾取出，固定于10%的福尔马林中，并用石蜡包埋。经过95%乙醇和无水乙醇脱水处理后，用二甲苯处理约30 min。然后，石蜡包埋、切片、脱蜡处理后，梯度脱水5 min。最后，通过苏木精和伊红着色，于显微镜下观察和评估每个图像中存在的炎症水平，炎症区会比非炎症区染得更浓，从而观察到细胞或组织的组成和病变。

第二阶段为依赖阶段，企业己建立较完整的安全条件和纪律约束，员工需要遵守安全规范要求，安全管理不只是安全管理人员的职责，其它员工也有义务参与。

1.3 统计学方法所得实验数据均通过SPSS 17.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差描述。当数据资料满足正态分布时，使用单因素方差分析（ANOVA），应用SNK⁃q检验进行多个样本均数间的两两比较；对于计数资料或计量资料不服从正态性且方差不齐时采用非参数检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 阻断Mcl⁃1表达信号通路促进了小鼠腹腔巨噬细胞凋亡应用阻断剂AG490、PD98059、LY294002阻断Mcl⁃1表达后，TUNEL技术检测了小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率。结果显示，与对照组相比，H37Ra感染组的凋亡率显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。阻断剂AG490、PD98059、LY294002作用于H37Ra感染的小鼠后，小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率均呈现不同程度的升高，其中阻断剂PD98059处理组的凋亡率显著高于AG490和LY294002处理组，差异有统计学意义（P＜0.05，图1A）。

2.2 PD98059处理减少了巨噬细胞内结核杆菌的数量考虑到阻断剂诱导凋亡的效果，检测了阻断剂PD98059处理后小鼠巨噬细胞内H37Ra的数量。菌落计数结果显示，与未处理的H37Ra感染组相比，阻断剂PD98059处理的H37Ra感染组小鼠巨噬细胞内H37Ra的菌落数量显著减少（P＜0.05，图1B），约减少了57.5%（从4.0× 107减少到1.7× 107）。

表1 抑制剂处理的H37Ra感染的小鼠巨噬细胞中Mcl⁃1的表达和凋亡率Tab.1 The expression of Mcl⁃1 and macrophages apoptosis rate in mice infected with H37Ra treated with inhibitors

图1 阻断剂处理对H37Ra感染的小鼠巨噬细胞凋亡和胞内结核分枝杆菌的影响Fig.1 Effect of inhibitors on apoptosis of macrophages and intracellular MTB in mice infected with H37Ra

2.3 阻断剂PD98059处理抑制了Mcl⁃1的表达细胞免疫化学检测了不同信号通路阻断剂处理对小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl⁃1表达的影响。数据结果显示，Mcl⁃1在H37Ra感染组的小鼠腹腔巨噬细胞中呈现阳性表达（表1）。用阻断剂AG490、LY294002处理的H37Ra感染的小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl⁃1的表达受到轻微抑制，而阻断剂PD98059处理组Mcl⁃1的表达受到明显抑制。与H37Ra感染组相比，在阻断剂PD98059处理的H37Ra感染组的小鼠腹腔巨噬细胞中，Mcl⁃1的表达被显著抑制，其阳性细胞只有20%（P＜ 0.05，表1）。

2.4 Mcl⁃1信号通路抑制剂处理减轻了结核感染的小鼠脏器的病理损伤

2.4.1 H37Ra感染组小鼠脏器变化与对照组相比，H37Ra感染组肺脏呈现肺毛细血管和间质大部分区扩张淤血，散在小灶肺间质内淋巴细胞、浆细胞浸润；肝脏呈现中央静脉淤血，汇管区灶性淋巴细胞、浆细胞浸润；脾脏呈现脾红髓明显扩张、淤血、出血；肾脏呈现肾间质部分区血管扩张、淤血（图2）。

2.4.2 阻断剂处理的H37Ra感染组脏器变化与对照组相比，阻断剂AG490和LY294002处理减轻了肺脏毛细血管和间质部分区、肝脏中央静脉、脾脏脾红髓及肾脏肾间质部分区的扩张淤血程度，而且减少了肝脏汇管区灶性炎性细胞的浸润（图2）。阻断剂PD98059处理明显减轻了肺脏肺毛细血管和间质、肝脏中央静脉、脾脏脾红髓、肾脏肾间质血管的淤血程度，而且脾脏的出血明显减轻（图2）。

3 讨论

巨噬细胞对抗结核感染的主要宿主细胞，可通过坏死、凋亡和自噬发挥免疫防御机制，影响感染的结局，而凋亡为主的死亡降低了不同真菌和细菌（包括结核分枝杆菌）的生存能力[8-10]。在结核感染期间，巨噬细胞中有多个分子及其相关信号通路参与了宿主细胞凋亡的调控。研究发现，Mcl⁃1在结核分枝杆菌感染的宿主巨噬细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用[4-5，11]。

图2 阻断剂处理的H37Ra感染的小鼠脏器的免疫组织变化Fig.2 Immunohistochemical changes of mice infected with H37Ra treated with inhibitors

目前，Mcl⁃1的表达主要是通过激活Janus激酶/信号传导及转录活化（janus kinase/signal trans⁃ducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路、磷脂酰肌醇激活（phosphatidylinositol 3⁃ki⁃nase，PI⁃3K）信号通路、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路来发挥作用[5-6]。JAK/STAT信号通路包括多种生物反应，如细胞增殖、凋亡和免疫系统调节[12]。大量的实验证实AG490可以促进肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞几乎没有副作用[13-14]。MAPK通路是MAPK/ERK通路的细胞外信号调节激酶[15]。PI⁃3K信号通路主要通过影响下游的各种效应分子，发挥抗凋亡作用[16]。当PI⁃3K信号通路抑制剂LY294002应用于人类巨噬细胞后，Mcl⁃1的表达水平显著降低[17]。而根据实验前期研究结果[4]，本实验仅分析了阻断剂处理后第5天Mcl⁃1干预对小鼠的影响。实验结果证实，3条信号通路阻断剂阻断Mcl⁃1表达后均能诱导H37Ra感染的小鼠巨噬细胞凋亡，其中以MAPK信号通路阻断剂PD98059处理组诱导凋亡效果最好（图1）。此实验结果证实，阻断Mcl⁃1的表达信号通路确实能够有效增加结核感染的宿主巨噬细胞凋亡。然而，对于Mcl⁃1信号通路阻断剂对于结核潜伏感染的消除作用还有待进一步论证。

课题组前期研究结果发现，MAPK信号通路阻断剂PD98059比PI⁃3K和JAK/STAT途径阻断剂诱导更多的小鼠腹腔巨噬细胞凋亡，且Mc⁃1蛋白表达明显下降[11]，因此，笔者推测MAPK信号通路是调控Mcl⁃1表达的主要通路。细胞免疫化学结果证实了笔者的推测，MAPK信号通路抑制剂PD98059处理H37Ra的小鼠巨噬细胞后，不仅Mcl⁃1的表达受到明显抑制（表1），而且宿主巨噬细胞内的菌落数量显著降低（图1）。除此之外，阻断剂PD98059与阻断剂AG490和LY294002相比，可明显减轻小鼠肺脏、肝脏、脾脏和肾脏各脏器的坏死程度，使病变程度得到改善（图2）。毫无疑问，这些结果很直观地证实，通过阻断Mcl⁃1表达的信号通路可有效消除结核杆菌的潜伏感染，而MAPK信号通路是其主要调控通路。

MAPK家族是细胞信号传导的重要枢纽，一系列的生物因子（如生长因子、淋巴因子、肿瘤促进因子及应激因子等）均可通过膜受体直接激活MAPK通路，从而调控细胞增殖、分化、代谢、凋亡等。而PI⁃3K信号通路的活化主要是通过RAS⁃RAF⁃MEK⁃ERK通路，间接调控细胞凋亡[18]。JAK/STAT信号转导通路阻断剂AG490是通过阻断多种细胞因子引起的JAK2/STAT3的磷酸化激活，继而阻断JAK/STAT信号转导路径。结核感染可使JAK2/STAT1⁃α磷酸化，从而诱导生成大量TNF⁃α[19]，导致Caspase酶系活性增强，从而启动细胞凋亡。然而，Caspases酶系可以分解 Mcl⁃1导致Mcl⁃1的水平上调。MAPK信号通路阻断Mcl⁃1表达时，可通过p38 MAPK和ERK两个分支拮抗TNF⁃α降低引起 Mcl⁃1 上调[5]。因此，当分别应用阻断剂AG490、PD98059和 LY294002阻断 Mcl⁃1的表达时，PD98059处理组作用最显著。由此可知，利用Mcl⁃1干预在结核潜伏感染中的特殊作用，有针对性的开发相应的药物或疫苗，必将加快人类战胜结核的脚步。

综上所述，阻断Mcl⁃1表达的信号通路可以显著促进结核感染的小鼠巨噬细胞的凋亡，减少结核杆菌在宿主巨噬细胞内的潜伏，减轻结核感染对小鼠脏器的病理损伤。而MAPK信号通路是此过程中的主要调控通路，PD98059为其特异性抑制剂。此研究从形态学角度分析了Mcl⁃1干预对结核感染的巨噬细胞的调控作用，不仅为当前耐多药结核病药物的研发提供了更多的思路和方向，还为Mcl⁃1干预应用于结核的预防与控制提供了更多的理论依据。然而，对于MAPK信号通路的详细调控机制在本研究中并未涉及，这也将是下一步的研究方向。