基于BSA模板荧光铜纳米簇的生物传感方法灵敏检测四环素

2018-10-16王海波董高丽白宏宇毛安丽

信阳师范学院学报（自然科学版） 2018年4期

王海波，董高丽，白宏宇，李阳，毛安丽

(信阳师范学院 a.河南省豫南非金属矿资源综合利用重点实验室；b.大别山农业生物资源保护与利用研究院，河南信阳 464000)

0 引言

四环素(TC)作为一类重要的抗生素，已经广泛用于革兰氏阳性菌和阴性菌引起的人类和动物感染的治疗[1].然而由于四环素的过度使用，经常会在日常食品中(如肉类、牛奶、蜂蜜等)发现四环素类抗生素残留.因此，发展四环素检测方法对于人类食品安全是非常重要的.目前，测定四环素的方法主要有高效液相色谱法、化学发光法、毛细管电泳法、衰减全反射傅立叶变换中红外分析法、伏安分析法等[2-4].但是这些方法还存在一些不足，如需要昂贵的仪器设备、复杂的样品准备程序以及费时的预处理过程.因此，开发简单、快速的四环素检测方法是迫切需要的.

荧光分析方法具有操作简单、分析速度快、灵敏度高、选择性好等优点，已经引起了研究人员的广泛研究兴趣[5].荧光金属纳米团簇作为一类新型的荧光纳米材料，具有毒性低、光稳定性强、生物相容性好、发射波长可调等优点.近年来，荧光金属纳米团簇已经成为研究热点之一[6].与金纳米簇、银纳米簇相比，铜纳米簇的合成原料相对便宜[7].但是，由于制备高稳定性的铜纳米簇比较困难，关于铜纳米簇研究的报道较少.此外，纳米尺寸的铜簇表面容易氧化，导致其分散性较差.近来，Goswami等人发现牛血清白蛋白(BSA)可以作为模板用于合成荧光铜纳米簇，所制备的铜纳米簇抗氧化能力强，稳定性好[8].因此，利用BSA模板的铜纳米簇作为探针构建荧光传感方法能够获得较好的分析性能[9, 10].

本文制备了BSA模板的铜纳米簇，并作为荧光探针，构建一种非标记型荧光生物传感新方法.利用四环素对BSA模板的铜纳米簇的荧光猝灭作用，提出一种测定四环素的荧光传感新方法.

1 实验部分

1.1 试剂

牛血清白蛋白(BSA)、CuSO4·5H2O等试剂均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；盐酸四环素、青霉素、氨苄西林、链霉素、林可霉素、头孢氨苄等抗生素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.缓冲体系为10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=8.0).实验过程中所用水均为超纯水，电阻率大于18.2 MΩ·cm.

1.2 仪器

F7000荧光光谱仪(Hitachi，日本)；Tecnai G2 F20 S-TWIN型场发射透射电子显微镜(TEM，FEI，美国).荧光信号测量采用氙灯作为光源，激发和发射狭缝均为5 nm，激发波长为335 nm，发射光谱波长扫描范围为385～600 nm.

1.3 BSA模板CuNCs的合成

CuNCs以BSA为模板，采用一步化学还原的方法进行合成.首先，在室温搅拌的条件下，将1 mL 20 mmol/L的CuSO4溶液加入到5 mL 15 mg/mL的BSA溶液中.室温下搅拌5 min，用1 mol/L的NaOH将上述混合溶液的pH值调节到12，溶液的颜色由蓝色变为紫色.将上述溶液在55 ℃搅拌条件下继续反应48 h，溶液颜色变为亮棕色.所得溶液置于4 ℃冰箱保存.

1.4 四环素的检测

1.5 牛奶样品的准备

纯牛奶样品购自当地超市.首先将纯牛奶样品用1%(体积分数)的三氯乙酸超声处理20 min，除去牛奶样品中的蛋白质.然后，样品用0.22m的滤膜进行过滤，除去样品中的脂类.收集清液用于下一步实际样品分析，采用标准加入法用于牛奶样品中四环素含量的测定.

2 结果与讨论

2.1 实验原理

非标记检测四环素的荧光传感方法原理如图1所示.在该方法中，荧光CuNCs以BSA为模板，采用一步化学还原的方法进行合成.在335 nm最大激发波长激发条件下，BSA模板的CuNCs具有较强的荧光信号.当传感体系中存在四环素时， CuNCs的荧光强度显著降低.这可能是由于四环素与BSA模板CuNCs表面的基团发生相互作用，导致荧光信号的降低.利用荧光强度的显著变化，本文设计了一种非标记型的荧光传感方法用于四环素的灵敏测定.

图1 非标记荧光传感方法示意图Fig. 1 Schematic illustration for the label-free fluorescent sensing strategy

2.2 BSA模板CuNCs的表征

BSA模板CuNCs的形貌通过透射电子显微镜(TEM)来进行表征.如图2A所示，BSA模板CuNCs的近似于球形，平均粒径在3 nm左右.BSA模板CuNCs的光学性能通过荧光激发光谱和发射光谱来进行考察.图2B为CuNCs的荧光激发光谱和发射光谱.从图中可以看出，CuNCs的最大激发波长为335 nm，最大发射波长为410 nm.此外，将BSA模板CuNCs置于4 ℃冰箱保存2个月，其荧光强度没有发生明显的变化，表明该CuNCs具有良好的稳定性，可以作为荧光指示探针用于构建荧光传感新方法.

图2 (A)BSA模板CuNCs的TEM图；(B)BSA模板CuNCs的荧光激发光谱图(a)和发射光谱图(b)Fig. 2 (A) TEM image of BSA templated CuNCs; (B) Fluorescence excitation (a) and emission (b) spectra of BSA templated CuNCs

2.3 荧光传感方法的可行性

为了评估该荧光传感方法用于四环素的可行性，不同条件下BSA模板CuNCs的荧光强度进行了考察.图3为不同条件下BSA模板CuNCs的荧光发射光谱图.如图3所示，BSA模板CuNCs在410 nm处有较强的荧光信号.当传感体系中存在四环素时，CuNCs的荧光强度显著减小，表明了该传感方法的成功构建.通过传感体系荧光信号的变化，可以实现四环素的灵敏检测.

图3 不同条件下的BSA模板CuNCs的荧光发射光谱图：(a)不存在四环素；(b)存在300 mol/L四环素Fig. 3 Fluorescence emission spectra of BSA templated CuNCs in the absence (a) and presence (b) of 300 mol/L tetracycline, respectively

2.4 实验条件的优化

为了获得该传感方法较好的分析性能，对缓冲溶液的pH值和四环素的孵育时间进行了优化.

图4 (A)缓冲溶液pH值的优化;(B)四环素孵育时间的优化Fig. 4 (A) The effect of pH value on the fluorescence intensity of BSA templated CuNCs in the absence and presence of 300 mol/L tetracycline, respectively. (B) The effect of incubation time oftetracycline on the fluorescence intensity of BSA templated CuNCs

如图4A所示，缓冲溶液的pH值为8.0时，体系的荧光响应最大，选择pH 8.0作为最佳条件.图4B为四环素孵育时间的优化，从图中可以看出，当四环素存在时，体系的荧光强度在1 min以内迅速降低，1 min后荧光信号没有明显变化，表明四环素与CuNCs的反应非常快速，1 min内达到平衡.

2.5 传感方法的分析性能

在优化实验条件下，对不同浓度四环素的荧光响应进行了考察.图5A为不同浓度四环素的荧光发射光谱图.从图中可以得出，随着四环素浓度的不断增加，荧光强度不断降低.如图5B所示，荧光信号(F0/F)与四环素浓度(CTC)呈现良好的线性关系，线性检测范围为5.0×10-8～ 4.0×10-5mol/L，其线性方程为F0/F=1.1284 + 0.0180CTC(CTC为四环素浓度，mol/L)，相关性系数R=0.9911，检出限为5.0×10-9mol/L.将本方法与文献报道的方法进行了比较，列于表1.结果表明，本方法具有较宽的线性范围和较高的灵敏度.

图5 (A)不同浓度四环素的荧光发射光谱图；(B)浓度校准曲线Fig. 5 (A) Fluorescence emission spectra of CuNCs in the presence of increasing tetracycline concentrations, the curves from top to bottom, the concentrations of tetracycline were 0, 0.05，0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 500 and 600 mol/L, respectively. (B) The calibration curve between fluorescence response and tetracycline concentrations. Where, F0 and F were the fluorescence intensity of the sensing system in the absence and presence of tetracycline, respectively

表1 不同四环素检测方法的分析性能比较Tab. 1 Performance comparison of the proposed method and other methods for TC detection

2.6 传感方法的选择性

在该传感方法中，CuNCs与四环素发生相互作用，导致荧光强度降低.为了验证该方法的选择性，我们考察了其他抗生素、金属离子、糖类、氨基酸对CuNCs的荧光信号的影响.结果表明，除了100mol/L的四环素类抗生素(盐酸四环素、土霉素、金霉素)能够产生显著的荧光信号降低，1 mmol/L的其他干扰物质(如Zn2+、Ca2+、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘氨酸、组氨酸)均无明显荧光信号降低，尤其是其他的抗生素(100mol/L的青霉素，氨苄西林，链霉素，林可霉素，头孢氨苄)不产生荧光强度降低，表明该传感方法具有良好的选择性，可以用于实际样品中四环素含量的测定.