腺病毒载体介导Smad3基因在秦川牛前体脂肪细胞中的过表达和沉默

2018-10-15李佩韦王洪宝昝林森

畜牧兽医学报 2018年9期

张乐，宁越，李佩韦，王洪宝，2，昝林森，2*

(1. 西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100； 2. 国家肉牛改良中心，杨凌 712100)

牛肉不仅肉质鲜美，而且具有高蛋白、低脂肪和低胆固醇等特点，其营养价值远高于其他肉类[1]。随着经济的发展和人们生活水平提高，牛肉供不应求，提高牛肉的产量和品质是迫在眉睫的问题[2]。一系列的研究表明，畜禽的产肉性能和肉品质离不开对骨骼肌生长发育及肌内脂肪含量的研究。TGF-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路调控了间充质干细胞的分化，抑制了脂肪细胞和成肌细胞的分化[3-5]。而Smad蛋白家族是将TGF-β与其受体结合后产生的信号从细胞膜传导到细胞核的重要中介分子。目前，Smad共分为3个不同的亚族：受体激活型Smads(receptor-activated Smad，R-Smad)主要包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9，可将TGF-β信号直接从细胞膜转导入细胞核内；共同通路型Smad(common Smad, C-Smad)即Smad4；抑制型Smads(inhibitory Smads, I-Smad)主要包括Smad6、Smad7[6-7]。Smad2/Smad3属于R-Smad，是TGF-β信号通路的直接作用底物，更是信号下传的第一个信号分子。而目前已有研究证明，在TGF-β1抑制成肌分化过程中起关键作用的是Smad3而非Smad2，同时Smad3表达水平的上调可抑制成肌调节因子的表达[8-9]。

目前对Smad3基因的研究主要是集中在哺乳动物胚胎发育时期以及出生后肌肉生长发育过程的调节，但其在成脂调控中的作用鲜有报道。有研究发现，TGF-β1抑制脂肪细胞分化的调控机制主要是通过与Smad3和Wnt /β-catenin信号通路之间的交流，从而下调了PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)的表达[10]。“双肌臀基因”肌肉抑制素(Myostatin)是TGF-β1家族成员之一，在机体内主要担任负调节作用。研究证明，MSTN抑制骨骼肌细胞生长、抑制褐色脂肪细胞分化和降低白色脂肪褐色化主要是通过调控Smad3基因控制的β-catenin的积累[11-12]。视黄素抑制脂肪细胞分化时，也需要与Smad3基因结合共同起作用[13]。这些研究表明，Smad3基因在脂肪和肌肉的生长发育过程中都起着负调控作用。

鉴于Smad3基因的重要功能，以及应用腺病毒介导技术以实现对秦川牛前体脂肪细胞的高效侵染和持续表达来研究该基因的功能尚未见报道。因此，本试验以秦川牛脂肪组织为试验材料，克隆秦川牛Smad3基因，构建了腺病毒过表达载体和重组干扰腺病毒载体，并获得了对秦川牛前体脂肪细胞Smad3有过表达能力的腺病毒AD-bSmad3和具有干扰能力的腺病毒AD-ShRNA-bSmad3，研究其对秦川牛前体脂肪细胞分化的调控作用，为进一步研究该基因和TGF-β信号通路在秦川牛脂肪组织生长发育过程中发挥的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

18月龄秦川牛的脂肪组织采自国家肉牛改良中心；pDC316-mCMV-EGFP、pDC316-EGFP-ShRNA载体质粒、JM109感受态细胞、Polyfectine购自深圳百恩维生物科技有限公司；小量质粒抽提试剂盒、Trans2K Plus II DNA Marker购自北京全式金生物公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Omega公司；限制性内切酶NotⅠ、NheⅠ，T4 DNA Ligase购自美国NEB公司；Qiagen大规模质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen公司；DMEM培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶Trypsin 0.25% EDTA购自美国Invitrogen公司；青链霉素双抗购自Gibco；ViraBind腺病毒纯化试剂盒购自美国Cell Biolabs公司；SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.2 重组腺病毒载体的构建

以秦川牛脂肪组织反转录cDNA为模板，根据GenBank公布的牛Smad3(GenBank accession NO.: NM_001205805)基因序列为参考，设计引物见表1，并在上、下游引物分别添加NheⅠ 和NotⅠ 酶切位点，用Fastpfupolymerase高保真酶扩增Smad3基因完整的CDS区，反应体系(50 μL)：DNA模板(100 ng·μL-1) 1 μL，Fastpfupolymerase 1 μL，5× Fastpfubuffer 10 μL，dNTP Mix (2.5 mmol·L-1) 4 μL，上下游引物各(10 μmol·L-1)2 μL，ddH2O 30 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃冷却10 min。胶回收酶切产物后再与穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP连接，穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP酶切体系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI和NotI各1 μL，质粒(500 ng·μL-1)2 μL，ddH2O 12 μL。目的基因bSmad3酶切体系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI和NotI各1 μL，PCR回收产物10 μL，ddH2O 4 μL。连接体系(10 μL)：pDC316-mCMV-EGFP质粒2 μL，bSMAD3 6.5 μL，10×DNA Ligase Buffer 1 μL，T4DNA Ligase 0.5 μL。用携带目的基因的重组质粒pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3以及骨架质粒共转染HEK293A细胞，获得携带目的基因Smad3的过表达腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3，标记为AD-bSMAD3；同时用重组质粒pDC316-EGFP做对照组病毒，标记为AD-NC。

以牛Smad3(GenBank accession NO.:NM_001205805)基因序列为模板，应用shRNA在线设计软件共设计3条特异shRNA，根据其靶向定位在Smad3基因CDS区的位置依次命名为shRNA-1247、shRNA-1405、shRNA-1486，经退火复性后克隆入穿梭质粒pDC316-EGFP-ShRNA 中。通过干扰效率检测后，选择pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405与骨架质粒共转染HEK293A细胞进行同源重组，获得重组干扰腺病毒载体pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405，标记为AD-ShRNA-bSMAD3；同时用重组质粒pDC316-EGFP-ShRNA做对照组病毒，标记为AD-ShRNA-NC。

表1PCR引物序列

Table1PrimersforPCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence产物大小/bp LengthGenBank登录号GenBank accession No.Smad3(CDS)F-CTAGCTAGCCACCATGTCGTCCATCCTGCCTTTCACR-ATTTGCGGCCGCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGA-GTTTTTGTTCC1 332NM_001205805Smad3(ShRNA-1405)F-GCATGTGCACCATTCGCATGATTCAAGAGATC-ATGCGAATGGTGCACATGCTTTTTTAGATCTGR-GATCCAGATCTAAAAAAGCATGTGCACCATTCGC-ATGATCTCTTG-AATCATGCGAATGGTGCACATGC600NM_001205805

1.3 重组腺病毒的包装、扩增及滴度测定

取鉴定好的重组病毒质粒4 μg，用Polyfectine将目的质粒转染到293A细胞,将细胞置于含5% CO2的37 ℃培养箱中孵育4～6 h后换液。待细胞达到80%～90%融合后，传代于25 cm2细胞培养瓶中，每天观察，待细胞达到80%～90%融合后，传代于75 cm2细胞培养瓶中，每天观察出毒迹象，即细胞收缩变圆并伴随有细胞脱落。待细胞大部分病变并从培养瓶壁脱落后，进行收毒，为病毒母液P1。用P1病毒上清感染293A细胞,发现细胞收缩变圆并伴随有细胞脱落时收集细胞，-80 ℃/37 ℃反复冻融3次，10 000 g离心10 min收集病毒上清，标记为P2；用同样的方法扩增病毒至P4代；用腺病毒纯化试剂盒纯化P4代病毒。用LaSRT法测定病毒滴度。

1.4 秦川牛前体脂肪细胞的培养及腺病毒感染细胞最佳MOI值测定

复苏实验室冷冻保存的秦川牛第1代前体脂肪细胞，经传代培养后，将细胞按1×104个·孔-1接种于两个24孔培养板中。前体脂肪细胞的培养基为DMEM/F-12、10% FBS。分别加入不同剂量的腺病毒(感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别为25、50、75、100、125和150)，每个处理设3个重复，48 h后根据细胞的生长情况及绿色荧光的表达情况来确定最佳的感染浓度。

1.5 腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞

复苏秦川牛第1代前体脂肪细胞，经传代培养到第3代时，将细胞按2×105个·孔-1接种于6孔培养板中，使用未诱导分化培养基(10%FBS+F12)培养。试验共设计4个处理组：AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC。待前体脂肪细胞汇合度达到90%时，按照MOI值添加腺病毒原液，12 h后换成脂肪细胞诱导分化培养基(0.25 mmol·L-1IBMX、1 μmol·L-1地塞米松和5 μg·mL-1胰岛素)的完全培养液；2 d后，撤去IBMX和地塞米松，使完全培养液中只含有5 μg·mL-1胰岛素；再2 d后换成脂肪细胞完全培养基，每2 d换液1次。分别在培养的第0、3、6、9天时收集细胞，提取RNA并进行油红O染色。

1.6 秦川脂肪细胞油红O染色

从培养箱中取出侵染腺病毒6 d的脂肪细胞，先弃去培养基，用PBS洗3次，再用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗3次。用油红O工作液(0.5 g的油红O染液，加入100 mL的异丙醇，37 ℃振荡混匀过夜为原液，使用时按照双蒸水与原液比例为2∶3的比例进行稀释并过滤)在室温下浸染细胞30 min，PBS清洗3次；在显微镜下观察照相。

1.7 实时荧光定量PCR检测基因的表达

用Trizol试剂提取转染Smad3基因第0、3、6、9天的前体脂肪细胞总RNA。各取1 μg RNA，按TaKaRa反转录试剂盒说明书合成cDNA，利用ABI7500实时荧光定量PCR仪使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行实时定量PCR，反应总体系为20 μL。检测Smad3基因及成肌和成脂相关基因的表达。定量引物相关参数见表2。反应体系(20 μL)：2 × SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA(<100 ng)2 μL，ROX Reference Dye II (50×Conc.) 0.4 μL，ddH2O 6 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性12 s，60 ℃退火34 s，40个循环；95 ℃预变性30 s；95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，40个循环。

表2定量引物序列

Table2PrimersforReal-timePCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence产物/bpLengthGenBank登录号GenBank accession No.Smad3F-AGCTGACACGGAGGCATATCR-CAGTTGGGAGACTGCACAAA109NM_001205805PPARγF-GAGATCACAGAGTACGCCAAGR-GGGCTCCATAAAGTCACCAA216NM_181024FABP4F-TGAGATTTCCTTCAAATTTGGGR-CTTGTACCAGAGCACCTTCATC101NM_174314C/EBPαF-ATCTGCGAACACGAGACGR-CCAGGAACTCGTCGTTGAA73NM_176784C/EBPβF-TTCCTCTCCGACCTCTTCTCR-CCAGACTCACGTAGCCGTACT79NM_176788GAPDHF-CCAACGTGTCTGTTGTGGATR-CTGCTTCACCACCTTCTTGA80NM_001034034β-actinF-CATCGGCAATGAGCGGTTCCR-ACCGTGTTGGCGTAGAGGTC147NM_173979.3

1.8 数据分析

试验数据以“平均值±标准误(mean±SE)”表示，采用SPSS13.0统计分析软件One-way ANOVA进行方差分析，用t检验(t-test)对不同试验处理之间的差异进行显著性分析。*表示P<0.05，**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 结果

2.1 秦川牛Smad3基因过表达腺病毒载体的构建

以脂肪组织cDNA为模板，设计Smad3基因PCR引物扩增CDS全长，琼脂糖电泳结果显示，其目的条带单一，大小为1 332 bp(图1A)。琼脂糖凝胶回收目的片段与pDC316-mCMV-EGFP连接，构建Smad3基因过表达腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3，用NheI和NotI双酶切检测并测序，双酶切得到2条条带，大小分别是1 332和5 885 bp(图1B)。同时测序结果发现，本试验得到的秦川牛Smad3基因序列与GenBank收录序列一致，证明过表达腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3构建成功。

2.2 秦川牛Smad3基因干扰腺病毒载体的构建

shRNA-1247、shRNA-1405、shRNA-1486经退火复性后克隆入穿梭质粒pDC316-EGFP-ShRNA中。通过在HEK293A细胞中干扰效率检测后，结果表明，pENTR/CMV-GFP/U6-1247、pENTR/CMV-GFP/U6-1405和pENTR/CMV-GFP/U6-1486均具有干扰效果，干扰效率分别为76.9%、83.3%、78.3%，其中pENTR/CMV-GFP/U6-1405的干扰效果相对较好(图2A)，因此选择shRNA-1405作为

最终使用的干扰序列，并构建重组腺病毒干扰载体pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405。用BglⅡ做酶切鉴定，在载体骨架上含有一个BglⅡ酶切位点，结合片段上的BglⅡ位点可切出600 bp的条带(图2B)。

M1. DL2000相对分子质量标准；M2. Trans2K plus marker DNA相对分子质量标准；1. PCR扩增秦川牛Smad3基因产物；2. pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3质粒Nhe Ⅰ和Not Ⅰ双酶切鉴定结果M1. DL2000 marker； M2. Trans2K plus marker; 1. Agarose gel electrophoresis of Smad3 gene PCR products; 2. Digestion identification of pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3 plasmid by Nhe Ⅰ and Not Ⅰ图1 Smad3基因克隆及pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3质粒的酶切鉴定Fig.1 Cloning of Smad3 gene and enzyme digestion identification of pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3

A. Smad3有效干扰shRNA序列的筛选(干扰效率为76.9%、83.3%、78.3%，**表示P<0.01)；B. pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405质粒Bgl Ⅱ酶切鉴定：M. Trans2K plus marker DNA相对分子质量标准；1. pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405质粒Bgl Ⅱ酶切鉴定结果A. Inhibitive efficiency of Smad3 selective shRNA(Inhibitive efficiency is 76.9%, 83.3%, 78.3%; ** indicate P<0.01); B. Digestion identification of pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405 plasmid by Bgl Ⅱ: M. Trans2K plus marker； 1. The result of digestion identification of pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405 plasmid by Bgl Ⅱ图2 Smad3基因干扰腺病毒载体的构建Fig.2 The construction of Smad3 shRNA adenovirus vectors

2.3 重组腺病毒的包装、扩增及滴度测定

用携带目的基因的重组质粒pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3以及骨架质粒共转染HEK293A细胞1 d后即可观察到绿色荧光；9 d后绿色荧光蛋白的表达量增多，并开始聚集形成彗星状，12 d后大部分细胞出现病变效应并从培养瓶壁脱落，此时收集的病毒即为病毒母液P1(图3A～3C和4A～4C)。第3代纯化后的腺病毒感染细胞仅24 h，就有约50%的细胞出现病变现象，此时收集的病毒即为具有较高滴度的第4代腺病毒(图3D和4 D)。采用LaSRT法测定滴度时，24 h后在显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白(图3E和4 E)，计算出腺病毒的滴度均为1×1010PFU·mL-1。用同种方法得到AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC的腺病毒滴度均为1×1010PFU·mL-1。

A.病毒重组子转染HEK293A细胞24 h绿色荧光情况观察；B.转染9 d绿色荧光形成彗星状的荧光聚集现象；C.转染12 d绿色荧光变亮并铺满整个视野，大量细胞变圆脱壁，形成空斑；D.高滴度病毒侵染HEK293A细胞24 h绿色荧光分布情况；E.病毒原液分别稀释102、103、104、105、106、107、108、109倍A. Fluorescence microscopic image of HEK293A cells transfected after 24 h; B. Fluorescence microscopic image after 9 d adenovirus transfection; C. Cytopathic effect (CPE) after 12 d adenovirus transfection; D. Fluorescence microscopic image after high titer adenovirus transfection for 24 h; E. The virus was diluted 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 and 109 times图3 过表达重组腺病毒的包装及病毒滴度测定Fig.3 Overexpression recombinant adenovirus packaging and their titer determining

2.4 秦川牛前体脂肪细胞的培养及腺病毒感染细胞最佳MOI值测定

复苏的秦川牛前体脂肪细胞经1周的传代培养后所得到的第3代细胞的形态大多数呈短梭形或多角形，细胞核呈圆形或椭圆形。将其接种于24 孔培养板中，并分别感染不同剂量的腺病毒。经48 h后观察发现，AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC的感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别为100、25、100、50时效果最好(图5A～5D)，此时细胞未出现明显的病变效应且绿色荧光表达量较多，所以确定此浓度为最佳感染浓度。

2.5 秦川牛前体脂肪细胞Smad3基因的过表达效率和干扰效率检测

高滴度过表达和干扰腺病毒侵染牛前体脂肪细胞3、6、9天时，荧光显微镜下都可以观察到有95%以上的细胞能成功表达绿色荧光蛋白。分别提取RNA，通过qRT-PCR试验发现，与对照组相比，Smad3基因表达量分别上调了1 031倍、1 286倍、633倍(图6A)和分别下调了70%、55%、57%(图6B)。这些结果表明，Smad3腺病毒过表达和干扰载体构建成功，为开展Smad3基因调控牛前体脂肪细胞的功能鉴定奠定了基础。

A.病毒重组子转染HEK293A细胞24 h绿色荧光情况观察；B. 转染9 d绿色荧光形成彗星状的荧光聚集现象；C.转染12 d绿色荧光变亮并铺满整个视野，大量细胞变圆脱壁，形成空斑；D.高滴度病毒侵染HEK293A细胞24 h绿色荧光分布情况；E.病毒原液分别稀释102、103、104、105、106、107、108、109倍A. Fluorescence microscopic image of HEK293A cells transfected after 24 h; B. Fluorescence microscopic image after 9 d adenovirus transfection; C. CPE after 12 d adenovirus transfection; D. Fluorescence microscopic image after high titer adenovirus transfection for 24 h; E. The virus was diluted 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 and 109 times图4 干扰重组腺病毒的包装及病毒滴度测定Fig.4 Interference recombinant adenovirus packaging and their titer determining

A. MOI值为100时感染AD-bSMAD3的牛前体脂肪细胞; B. MOI值为25时感染AD-NC的牛前体脂肪细胞; C. MOI值为100时感染AD-ShRNA-bSMAD3的牛前体脂肪细胞; D. MOI值为50时感染AD-ShRNA-NC的牛前体脂肪细胞A. MOI value is 100, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-bSMAD3; B. MOI value is 25, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-NC; C. MOI value is 100, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-ShRNA-bSMAD3; D. MOI value is 50, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-ShRNA-NC图5 Smad3基因重组腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞最佳MOI值测定Fig.5 Qinchuan cattle preadipocytes infected by Smad3 recombinant adenovirus with the optimal MOI value

2.6 Smad3基因抑制秦川牛前体脂肪细胞分化

腺病毒侵染牛前体脂肪细胞后，收集成脂诱导分化第6天的细胞，进行油红O染色。对脂质聚集观察发现，AD-bSMAD3处理组明显的减少了脂滴积累，而AD-ShRNA-bSMAD3处理组的脂滴积累则明显增加(图7A)。同时，qRT-PCR检测发现，与AD-NC组相比，AD-bSMAD3处理组的成脂标志基

因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的 mRNA水平均显著地下调,相反地，与AD-ShRNA-NC组相比，AD-ShRNA-bSMAD3处理组的成脂标志基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的mRNA水平均显著地上调(图7B)。结果表明，Smad3基因能够显著的抑制秦川牛前体脂肪细胞的分化。

A. Smad3基因过表达效率检测；B. Smad3基因干扰效率检测。不同处理间，**表示P<0.01, ***表示P<0.001，下图同A. The overexpression efficiency Smad3 gene; B. The interference efficiency of Smad3 gene. Between different treatments: **. P < 0.01, ***. P<0.001, the same as the following figure图6 Smad3基因过表达效率和干扰效率检测Fig.6 Detection of overexpression and interference efficiency of Smad3 gene

A.秦川牛前体脂肪细胞在侵染AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC后，诱导分化6天，油红O染色图；B. 成脂标记基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的表达检测A. Oil Red O staining for day 6 Qinchuan cattle preadipocyte infected by AD-bSMAD3, AD-NC, AD-ShRNA-bSMAD3, AD-ShRNA-NC； B. Detection of PPARγ, FABP4, C/EBPα and C/EBPβ expression图7 腺病毒介导Smad3基因调控秦川牛前体脂肪细胞分化Fig.7 Smad3 gene regulating the Qinchuan cattle preadipocyte differentiation mediated by adenovirus

3 讨论

肌内脂肪的分布和含量决定了大理石花纹丰度，而大理石花纹的丰度是衡量牛肉品质的重要指标。动物体内，脂肪组织的沉积以及脂质的合成主要是由脂肪细胞数量增多以及体积的不断增大决定的[14]。目前已经证实，TGF-β超家族成员在脂肪细胞分化和诱导中对脂滴合成与沉积起到关键的调控作用[15-16]。而在TGF-β信号通路中，Smad3蛋白起到至关重要的作用，它们能将信号由细胞膜转至细胞核中从而调节靶基因的转录，是TGF-β家族的直接作用底物[17-18]。秦川牛的Smad3基因定位于10号染色体上，CDS区全长1 278 bp，编码了425个氨基酸。本试验利用秦川牛脂肪组织反转录cDNA为模板在高保真酶的作用下成功克隆得到秦川牛Smad3基因序列。由于腺病毒载体产生的病毒颗粒比较稳定，能有效地将外源基因转染到各种靶细胞或组织中，病毒的包装容易，且滴度易于提高，并且不会对人的身体健康产生影响，这使得腺病毒成为细胞试验中最常用的病毒载体之一，成为表达和传递治疗基因的主要候选者[19-20]。为了更好地研究Smad3基因在秦川牛脂肪的生长发育过程中起到的调控作用，选择利用腺病毒的侵染性以实现目的基因Smad3在真核细胞的过表达和干扰。本试验采用Ad5腺病毒改造的AdMaxTM重组腺病毒包装系统，与前期使用的腺病毒载体系统ViraPowerTMAdenoviral Expression System及AdEasyTMAdenoviral Vector System不同，只需要连接穿梭载体然后在重组酶的作用下进行细胞内重组，而且包装过程需要不断传代，但是获得的腺病毒滴度和侵染效率均较高[21-23]。相同点是，与脂质体等介导的化学试剂转染法，应用电转移、核转移等物理方法比较，这几种腺病毒载体都能最大限度的保护细胞不受损伤，还能使细胞保持良好的生长状态[24-25]。本研究最后选择了试验中所得到的4代过表达腺病毒，其滴度可以达到1×1010pfu·mL-1。按MOI值侵染秦川牛前体脂肪细胞3、6、9 d后，与Ad-NC对照组相比，牛成肌细胞中Smad3基因的表达量显著上调了1 031、1 286、633倍(P<0.001)。同样用所得到的4代腺病毒干扰病毒AD-ShRNA-bSMAD3，与AD-ShRNA-NC对照组相比，Smad3基因的表达量分别下调了70%，55%，57%(P<0.01)。说明腺病毒AD-bSMAD3和AD-ShRNA-bSMAD3具有很好的过表达和干扰效果，为下一步研究Smad3基因在成脂分化过程中的作用奠定了基础。

脂肪的生长发育是依赖于多种信号通路和转录因子相互作用的级联反应。有一些促进脂肪生成的因素，如在成脂发生的早期阶段，C/EBPβ(CCAAT enhancer binding proteinsβ)显著上调，然后激活了C/EBPα(CCAAT enhancer binding proteinsα)和PPARγ表达；C/EBPα和PPARγ互相调控进一步激活了下游成脂基因FABP4(fatty acid binding protein 4)和FASN(fatty acid synthase)的表达，进而促进了成熟脂肪的形成[26-28]。有研究发现，TGF-β超家族配体在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化过程中起着十分重要的作用，但其在脂肪形成过程中的详细功能至今也不是很清楚。研究表明，TGF-β在肥胖的模式动物和人体内高表达，在脂肪细胞中脂肪的形成过程中会被Smad3抑制[12-13]。而在Smad3缺失的小鼠体内，饮食诱导的肥胖会被抵制,并且这些小鼠的脂肪形成能力会显著降低[29-30]。也就是说TGF-β信号通路对脂肪的调控在体内和体外的研究结果是相互矛盾的，其具体调控机制有待进一步的验证。有研究表明，TGF-β信号通路抑制脂肪的生成有一部分依赖于Smad3信号通路。Smad3被TGF-β激活后，与C/EBPβ和C/EBPδ(CCAAT enhancer binding proteinsδ)结合，抑制他们的转录活动，这反过来导致了PPARγ转录的减少，是脂肪生成的主要调节剂，从而抑制了脂肪生成的过程[31]。然而，也有报道证明，TGF-β信号通路抑制脂肪的生成也可以不依赖于Smad3基因[32]。为了进一步研究Smad3基因的调控机制，本试验利用前期获得的高滴度腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞，由油红O染色结果发现，过表达Smad3基因后能够抑制细胞中脂滴的沉积，相反地，干扰Smad3基因后，能够促进细胞中脂滴的形成。实时荧光定量PCR结果显示，Smad3基因显著的下调了成脂基因C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ和FABP4的表达。这些结果初步证明，Smad3可能参与了脂肪生成的早期调控，是调控秦川牛前体脂肪细胞分化的一个负向调控因子。而Smad3基因对C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ和FABP4基因是直接调控作用还是间接调控作用需要进一步探讨研究。