5个马铃薯新品系染色体构型及遗传差异的SSR分析

， ， 肖夏， ， ， ，

(内蒙古农业大学 农学院， 呼和浩特 010019)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)为茄科一年生具块茎的作物，其粮、菜、饲兼用，经济价值高[1-3]。随着我国主粮化战略的深入实施，马铃薯在农业生产中的地位不断提高。

新品种是马铃薯产业发展的重要基础。随着人民生活水平的不断提高，对优质特色马铃薯新品种的需求呈增涨趋势[4-6]。近几年来，为培育适应性强、优质高产稳产的马铃薯新品种，根据遗传差异大、优缺点互补的亲本选配原则，用生育期较短、花青素含量高的四倍体(2 n=4 x=48)彩色马铃薯品系‘彩异’和‘四彩’为母本，分别与适应性强、干物质和淀粉含量高的四倍体父本材料‘民Ⅱ’和‘陇薯7号’进行杂交，通过对杂交后代优良单株选育，获得‘彩异×民Ⅱ’、‘四彩×民Ⅱ’和‘四彩×陇薯7号’3个杂交组合的5个优良杂种新品系NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-A 11、NNS-B 2和NNS-C 2。

表1 适宜SSR引物及其序列

引物名称正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) C5TACCTCTTGCTGACGTGGTGGCTCTTCCCTTCTGTGCATCS25GCGAATGACAGGACAAGAGGTGCCACTGCTACCATAACCAS7GACTGGCTGACCCTGAACTCGACAAAATTACAGGAACTGCAAAS151GCTGCTAAACACTCAAGCAGAACAACTACAAGATTCCATCCACAGS118AGAGATCGATGTAAAACACGTGTGGCATTTTGATGGATTS189CCTTGTAGTACAGCAGTGGTCTCCGCCAAGACTGATGCAS170CGCAAATCTTCATCCGATTCTCCGGCGGATAATACTTGTTSTM0030AGAGATCGATGTAAAACACGTGTGGCATTTTGATGGATTSTM0019aAATAGGTGTACTGACTCTCAATGTTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTGSTL003ACCATCCACCATGTCAATGCCTCATGGATGGTGTCATTGG

本试验以亲本作对照，采用染色体制片法和SSR分子标记技术[7-8]，重点对这5个新品系花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)的染色体配对行为和SSR指纹特征进行分析，以明确新品系间的染色体构型特征和DNA水平的遗传差异，为下一步优良新品种的育成登记和保护利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为马铃薯优良杂种新品系NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-A 11和其亲本‘四彩×民Ⅱ’，新品系NNS-B 2和其亲本‘彩异×民Ⅱ’，新品系NNS-C 2和其亲本‘四彩×陇薯7号’。种薯由内蒙古农业大学马铃薯遗传育种研究所提供。各材料均种植在内蒙古农业大学农场的网棚中，生长期间适时适量灌水施肥，以满足植株生长发育对水分和养分的需求，并及时防除病虫和杂草的危害。

1.2 方 法

1.2.1 染色体配对行为观察

随机取5个马铃薯双亲及其新品系的幼小花蕾(现蕾初期)，分别放在装有卡诺液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1，0.5% FeCl3)的具塞试管中，黑暗条件下固定24 h后，清水冲洗花蕾，加入75%的酒精，置于4 ℃冰箱内备用。制片时，用解剖针将花药中的花粉挤出，去掉花药壁等杂质，加1滴卡宝品红溶液染色，盖玻片后用镊子均匀敲打并压片。用40倍Olympus Corporation显微镜观察各材料的染色体配对行为，选取染色体清晰、分散均匀的细胞统计染色体数目，并在100倍油镜下照相[9]。

1.2.2 基因组DNA提取及检测

在苗期随机取各供试材

料的新鲜幼嫩叶片，用北京天根公司生产的试剂盒提取基因组DNA。每种材料吸取2μL DNA溶液，用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测，稀释后置-40 ℃冰柜中保存备用。

1.2.3 SSR-PCR反应体系及程序

SSR反应体系总体积为20μL，包含：1.0μL模板DNA(50 ng/μL)、上下游引物(0.5μmol/L)各0.7μL、2.0μL 10×PCR buffer(含Mg2+)、0.09μLTaqDNA聚合酶(5 U)、1.4μL dNTPs(0.225 mmol/L)和14.11μL ddH2O。试验所用生化试剂均购自于北京全式金生物工程有限公司。

SSR-PCR扩增程序：95 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增后样品于4 ℃低温保存。

1.2.4 扩增产物电泳检测

配置6% PAGE凝胶，变性扩增产物的上样量为5.5μL，于70 W恒定功率下电泳约1 h。将电泳后的胶板利用银染法进行染色：置于固定液(1 800 mL蒸馏水+20 mL冰乙酸+200 mL酒精)中10 min，取出经蒸馏水漂洗约2 min后，再置于2.0%的硝酸银溶液中染色10 min，再用蒸馏水迅速漂洗5 s后，于显影液中显色，胶板置于室内晾干并扫描照相[10]。

1.2.5 适宜引物筛选

本试验从100对马铃薯SSR引物中(NCBI网站公布，委托上海生物工程有限公司合成)筛选出多态性好、条带稳定清晰的10对SSR适宜引物(表1)，用于马铃薯亲本及其5个新品系的SSR分析。

1.2.6 SSR多态性统计

采用0/1赋值法，对扩增出的多态性位点进行统计，无带记为“0”，有带记为“1”，生成“0”、“1”矩阵。若扩增位点没有多态性，则只记录对该引物的扩增条带总数[11]。多态性条带百分率(简称P)：P=(具有多态性的条带数目/扩增条带总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 马铃薯新品系染色体构型比较

从图1和表2可知，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)时，马铃薯双亲及其各品系间的单价体、二价体、三价体和四价体的频率变幅分别为1.95～8.27、9.26～15.46、1.35～4.43和1.98～2.83，这表明5个新品系及其亲本的PMCMⅠ染色体配对行为有一定差异。母本‘彩异’和‘四彩’的染色体构型分别为2 n=4 x=48=9.17 Ⅰ+8.95 Ⅱ+4.55 Ⅲ+1.82 Ⅳ和2 n=4 x=48=3.54 Ⅰ+12.77 Ⅱ+2.65 Ⅲ+2.74 Ⅳ；父本‘陇薯7号’和 ‘民Ⅱ’分别为2 n=4 x=48=2.32 Ⅰ+14.15 Ⅱ+1.94 Ⅲ+2.89 Ⅳ和2 n=4 x=48=7.85 Ⅰ+10.89 Ⅱ+3.73 Ⅲ+1.79 Ⅳ；5个新品系NNS-C 2、NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-B 2和NNS-A 11的染色体配对构型依次分别为2 n=4 x=48=1.95 Ⅰ+15.46 Ⅱ+1.35 Ⅲ+2.77 Ⅳ、2 n=4 x=48=5.66 Ⅰ+11.47 Ⅱ+3.6 Ⅲ+2.15 Ⅳ、2 n=4 x=48=2.98 Ⅰ+13.54 Ⅱ+2.2 Ⅲ+2.83 Ⅳ、2 n=4 x=48=8.27 Ⅰ+9.26 Ⅱ+4.43 Ⅲ+1.98 Ⅳ和2 n=4 x=48=3.47 Ⅰ+12.13 Ⅱ+3.21 Ⅲ+2.66 Ⅳ。

注：a为品系NNS-A 6；b为品系NNS-A 10；c为品系NNS-A 11；d为品系NNS-B 2；e为品系NNS-C 2；f为♀四彩；g为♀彩异；h为♂民Ⅱ；i为♂陇薯7号。图1 马铃薯新品系及其亲本的染色体配对行为

表2 马铃薯新品系及其亲本染色体配对构型

材料观察细胞数单价体Ⅰ二价体Ⅱ三价体Ⅲ四价体Ⅳ品系NNS-C2265 1.9515.461.352.77品系NNS-A6242 5.6611.473.62.15品系NNS-A10257 2.9813.542.22.83品系NNS-B2249 8.279.264.431.98品系NNS-A11260 3.4712.133.212.66♀彩异236 9.178.954.551.82♀四彩255 3.5412.772.652.74♂陇薯7号252 2.3214.151.942.89♂民Ⅱ268 7.8510.893.731.79

2.2 新品系遗传差异的SSR分析

从图2-A看出，5个马铃薯新品系及其亲本的基因组DNA电泳条带稳定、均匀清晰、无弥散和拖尾现象，表明提取的各材料DNA纯度很高，可进行SSR分子标记电泳分析。

由表3可知，用筛选出的10对多态性引物对马铃薯亲本双亲及其5个优良新品系的基因组DNA进行SSR-PCR扩增，共得到128个清晰稳定的SSR条带，其中多态性条带106个，多态性比率占82.81%。

注：A为DNA 纯度检测；B为引物S189；C为引物S25；D为引物STM 0030。M为DL 2000；1为品系NNS-A 6；2为品系NNS-A10；3为品系NNS-A 11；4为品系NNS-B 2；5为品系NNS-C 2；6为♀四彩；7为♀彩异；8为♂民Ⅱ；9为♂陇薯7号。图2 5个马铃薯新品系和亲本基因组DNA纯度检测结果及用3对特异性引物PCR扩增的SSR指纹图

本试验从10对SSR适宜引物中选出能在DNA水平上清晰地区分各新品系及其亲本的3对SSR引物S 189、S 25和STM 0030，经PCR扩增建立了5个新品系的SSR指纹图(图2-B、C、D)，这为下一步新品种的育成登记和保护利用提供了分子依据。

表3 新品系及其亲本的SSR扩增结果

引物名称多态性条带扩增条带总数多态性比率(%)C581172.73S25131492.86S7101376.92S15181172.73S118111478.57S1891010100.00S170121580.00STM003091275.00STM0019a131586.67STL003121392.31总数10612882.81(均值)

3 讨 论

染色体是DNA遗传物质的载体，观察染色体配对行为是在细胞学水平上了解不同作物遗传差异的基础，对作物杂交育种研究具有重要理论指导意义[12]。研究表明，当植物染色体构型中的二价体频率较高时，其花粉可育率较高，而单价体或多价体频率较高时，花粉可育率常较低[13]。其原因是二价体频率高，同源染色体可以正常联会，因而花粉育性也高；而单价体或多价体频率高，常会引起联会的同源染色体不均衡分离，造成染色体配对异常，花粉育性降低[14]。本试验从‘彩异×民Ⅱ’、‘四彩×民Ⅱ’和‘四彩×陇薯7号’这3个杂交组合的杂种F1分离群体中，选育出的5个马铃薯优良新品系NNS-C 2、NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-B 2和NNS-A 11的染色体配对构型数据结果与前人在其他作物上的研究结果一致。如新品系NNS-C 2的二价体频率较高(15.46)，而单价体和多价体频率相对较低(1.95)；新品系NNS-B 2的二价体频率较低(9.26)，而单价体和多价体频率较高(8.27)。这为今后5个新品系作为中间材料进一步用于杂交改良利用提供了可靠的细胞遗传学依据。

SSR分子标记具有多态性好、电泳条带稳定、操作简单及成本较低等优点，呈遗传共显性，很适合于作物杂交后代的鉴定[15-16]。本试验利用筛选出的10对SSR多态性适宜引物，对马铃薯亲本材料及其5个优良新品系的基因组DNA进行SSR-PCR扩增得到多态性条带106个，多态性比率高达82.81%，这说明供试材料间的遗传差异较大。试验还利用3对SSR特异性引物S 189、S 25和STM 0030，PCR扩增建立了能识别各新品系和其亲本的SSR指纹图，再次表明SSR分子标记技术用于马铃薯新品系的鉴定是可靠的。

4 结 论

1) 5个马铃薯新品系NNS-C 2、NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-B 2和NNS-A 11的染色体构型，依次分别为1.95 Ⅰ+15.46 Ⅱ+1.35 Ⅲ+2.77 Ⅳ、5.66 Ⅰ+11.47 Ⅱ+3.6 Ⅲ+2.15 Ⅳ、2.98 Ⅰ+13.54 Ⅱ+2.2 Ⅲ+2.83 Ⅳ、8.27 Ⅰ+9.26 Ⅱ+4.43 Ⅲ+1.98 Ⅳ和3.47 Ⅰ+12.13 Ⅱ+3.21 Ⅲ+2.66 Ⅳ。

2) 筛选出适用于5个优良新品系及其亲本基因组DNA多态性分析的SSR适宜引物10对，并明确了各新品系在DNA水平上的遗传差异，建立了新品系及其亲本的SSR指纹图。