多重DPO—PCR检测转基因玉米MON810和MIR604体系建立

周陆宁 张锐 麦晨 魏霜

摘要 针对转基因玉米MON810和MIR604品系插入位点序列，分别设计品系特异性DPO引物，建立转基因玉米MON810和MIR604品系检测的多重DPO-PCR方法。结果表明，设计的DPO引物特异性强，灵敏度达0.5 ng/μL，并且对退火温度不敏感。该检测方法特异性强、灵敏度高，适合于对转基因玉米MON810和MIR604品系进行快速检测。

关键词 转基因玉米；MON810；MIR604；多重DPO-PCR

中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）17-0001-02

Abstract Specific DPO primers based on the sequence of exogenous fragments of genetically modified maize MON810 and MIR604，a multiplex DPO-PCR method has been developed for the detection of genetically modified maize MON810 and MIR604 simultaneously. The specificity and sensitivity of the method have been tested，the results showed that the DPO primers were of high specificity，the sensitivity of the method was 0.5 ng/μL and insensitive to the annealing temperature. This method has strong specificity and high sensitivity，and is suitable for rapid detection of genetically modified maize MON810 and MIR604.

Key words genetically modified maize；MON810；MIR604；multiplex DPO-PCR

截至2016年，全球转基因作物种植面积达1.851亿hm2，同比增加3%[1]。随着大量转基因农产品的涌现，转基因作物的安全性问题不容忽视。我国颁布了相关法律法规及条例，规定了转基因标识制度及要求。

PCR是检测转基因的主要方法之一，但普通PCR检测通量较低。多重PCR是在反应体系内加入多对引物，可同时检测多个靶基因，在提高检测通量的同时也降低了检测成本。传统多重PCR体系中，引物之间存在退火温度、引物二聚体、错配等差异，容易造成灵敏度下降、非特异性扩增等问题。

双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型PCR引物设计方法[2]。原理：引物的5′端序列由18～25个碱基组成，而3′端序列由6～12个碱基组成，2段引物用寡聚次黄嘌呤（inosine，I）进行连接，次黄嘌呤的退火温度低，可以让引物在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使引物形成2个独立的双特异性引物结构。研究表明，DPO引物的5′端和3′端引物区域中任何一端有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，大大提升了引物的特异性。该技术为多重PCR提供了一种新的引物设计方式，并已经广泛应用于病原菌检测中[3-7]。因此，本研究旨在建立基于DPO引物的多重PCR方法，用于同时检测转基因玉米MON810和MIR604品系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供試品系：转基因玉米MON810、转基因玉米MIR604、转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT1

76、转基因玉米MON89034、转基因大豆GTS40-3-2、转基因油菜GT73、转基因水稻TT51-1、非转基因玉米，样品均保存于中国检验检疫科学研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计。根据转基因玉米MON810和MIR604的插入序列两端设计DPO引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2.2 DNA提取。采用试剂盒法提取样品基因组DNA，并用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，保存于-20 ℃备用。

1.2.3 多重DPO-PCR体系建立。参考Takara多重PCR试剂盒的反应体系：各引物终浓度均为0.4 μmol/L、DNA模板1.0 μL、Mix 1溶液0.25 μL、Mix 2溶液25 μL，用ddH2O调整反应体系的体积至50 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR结束后，采用2.0%琼脂糖电泳分析。

1.2.4 特异性评价。按照1.2.3多重DPO-PCR反应体系，以转基因玉米MON810、转基因玉米MIR604、转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT176、转基因玉米MON89034、转基因大豆GTS40-3-2、转基因油菜GT73、转基因水稻TT51-1、非转基因玉米的基因组DNA为模板，对多重DPO-PCR反应体系进行特异性评价。

1.2.5 灵敏度评价。将转基因玉米MON810和MIR604的基因组DNA标定浓度为50.00 ng/μL，再将其浓度稀释为5.000、0.500、0.050、0.005 ng/μL，分别取1 μL作为模板进行多重DPO-PCR扩增，进行灵敏度评价。

1.2.6 退火温度敏感性试验。按照1.2.3多重DPO-PCR反应体系，将退火温度设为50～65 ℃，每5 ℃为1个梯度，共4个梯度，以转基因玉米MON810和MIR604的基因组DNA混合物为模板进行退火温度敏感性试验。

2 结果与分析

2.1 多重DPO-PCR检测方法建立

由图1可知，建立了转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR检测方法，多重DPO-PCR检测结果与单重DPO-PCR检测结果一致，即在266 bp和127 bp处有特异性条带。

2.2 特异性评价

由表2可知，转基因玉米MON810和MIR604为阳性，而其他8种非靶目标样品均为阴性，所建立的多重DPO-PCR检测方法特异性强。

2.3 灵敏度评价

由图2可知，DNA模板含量在50.000、5.000、0.500 ng/μL时均可扩增出2条目的条带，且呈依次减弱；当模板含量降到0.050 ng/μL以下时，未能擴增到目的条带。

2.4 退火温度敏感性试验

由图3可知，多重DPO-PCR在50、55、60、65 ℃这4个退火温度梯度下均能扩增出目的基因，表明建立的多重DPO-PCR检测方法对退火温度不敏感。

3 结论与讨论

试验结果表明，设计的DPO引物特异性强，灵敏度达0.500 ng/μL，且对退火温度不敏感，由此建立了多重DPO-PCR方法用于转基因玉米MON810和MIR604的检测。该方法特异性强、灵敏度高、对退火温度不敏感，适用于食品、饲料等样品中这2个转基因玉米品系的快速筛检。

4 参考文献

[1] CLIVE JAMES.2015年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J].中国生物工程杂志，2016，36（4）：1-11.

[2] CHUN J Y，KIM K J，HWANG I T，et al.Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene[J].Nucleic Acids Res，2007，35（6）：40.

[3] 张娜，乾义柯，魏霜，等.两种向日葵检疫性真菌病害的多重DPO-PCR检测方法[J].植物检疫，2015（6）：35-38.

[4] 李丹丹，徐义刚，王昱，等.创伤弧菌DPO-PCR检测方法的建立[J].食品科技，2015，40（11）：287-290.

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