丹参酮 ⅡA对Adriam诱导的人肾小球系膜细胞凋亡的保护作用

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(延安市人民医院肾内科，陕西 延安 716000)

慢性肾病是一类肾功能进行性退化的疾病[1-2]。据统计，全球约有超过10%的人都患有慢性肾病，严重影响人类的身体健康[3]。药物引起的慢性肾病是临床常见的慢性肾病之一。阿霉素 (adriamycin,Adriam) 是一类蒽环类衍生物，临床常用于治疗癌症，但其大量的使用可造成肾损伤[4-5]。Adriam引起肾小球损伤，表现为进行性蛋白尿，最终导致肾功能衰竭[6]。目前对于Adriam引起的慢性肾病的治疗方式主要包括透析和肾移植手术，但由于长期透析及肾移植手术费用昂贵，仅有1%的慢性肾病患者能从中获益[1]。因此，寻找新的慢性肾病治疗药物是目前研究的热点。近年来研究发现，中药在慢性肾病的治疗中具有一定的优势[7]。丹参酮ⅡA (tanshinone ⅡA,TSⅡA) 是我国传统中药丹参的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡及抗动脉粥样硬化等活性，常被用于心血管疾病的治疗[8-9]。也有研究表明，TSⅡA能减轻急性肾损伤大鼠肾纤维化[10]。但TSⅡA对Adriam诱导的肾小管系膜细胞凋亡的作用还未见报道。因此，本文采用Adriam处理人肾小管系膜细胞以探究TSⅡA对肾小管系膜细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RMPI 1640培养液、胎牛血清和胰酶购自美国Invitrogen公司；TSⅡA购自中国药品生物制品检定所(批号：110766-201416)；Adriam购自西安利君制药有限公司(生产批号：160411)；Annexin-PE试剂盒(货号：C1065)、CCK8试剂盒(货号：C0038)、BCA试剂盒(货号：P0010)购自碧云天生物科技技术研究所，Hoechst 33256染色液(货号：C0030)和RIPA裂解液(货号：R0010)购自北京索莱宝生物技术公司；Caspase-3(货号：ABC495)和Caspase-9(货号：AB3629)购自美国Millipore公司，二抗购自北京博奥森生物科技公司。

1.2 细胞培养

人肾小球系膜细胞株HMCL购自中国科学院细胞库(上海)。用含有10%胎牛血清、100 U/mL和100 μg/mL的RMPI 1640培养液培养HMCL细胞，培养条件为37 ℃、5% CO2。每2天换液1次，细胞融合率达到85%以上时进行传代培养。

1.3 细胞分组及模型复制

将HMCL细胞接种于培养板中，随机分为HMCL组、Adriamycin组、Adriam+TSⅡA(5 μM) 组、Adriam+TSⅡA(10 μM)组和Adriam+TSⅡA(20 μM) 组，每组6个复孔。除HMCL组外，其余组均加入Adriam处理细胞并使其终浓度为1 μM，Adriam+TSⅡA(5,10,20 μM) 组同时加入5,10,20 μM的TSⅡA处理细胞，24 h后进行检测。

1.4 CCK8检测细胞增殖

将细胞接种于96孔板中，密度为1×105个/mL。培养24 h后进行模型复制并加入不同浓度的TSⅡA处理细胞，24 h后根据CCK8试剂盒说明书检测各组细胞吸光度，计算细胞增殖倍数(增殖倍数=细胞吸光度/0 h HMCL组细胞吸光度。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

用TSⅡA处理细胞后，用胰酶收集细胞，以1 000 g的转速离心5 min，并用磷酸盐缓冲液对细胞进行重悬沉淀，并再次离心，随后加入195 μL的结合缓冲液将细胞密度调整为1×106个/mL，并加入5 μL的Annexin V-PE室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 Hoechst染色检测细胞凋亡

将细胞用TSⅡA处理后，用4%的多聚甲醛室温固定细胞30 min。固定完成后用磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5 min。随后加入Hoechst染色液，以覆盖细胞为宜，室温染色30 min后，弃去Hoechst染色液，用磷酸盐缓冲液清洗3次后，于显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.7 Western blot检测细胞凋亡蛋白的表达

将用TSⅡA处理后的细胞用磷酸盐缓冲液清洗3次，用RIPA裂解液提取各组细胞蛋白，并用BCA试剂盒检测细胞蛋白浓度。用12% SDS-PAGE分离蛋白，用半干法将蛋白转移到PVDF膜上，并用脱脂牛奶封闭蛋白质2 h。随后以1∶1 000的浓度加入Caspase-3和Caspase-9一抗，4 ℃封闭过夜，第2天用缓冲液洗去未结合一抗，加入二抗，室温孵育1 h后，滴加化学发光显色液于暗室曝光显影。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 TSⅡA对肾小球系膜细胞增殖的影响

为了探究TSⅡA的最佳用药浓度，本文采用不同浓度的TSⅡA处理细胞，实验结果表明，当TSⅡA浓度达到50 μM及以上时细胞活性明显降至80%以下(图1)，因此在后续实验中选择5,10,20 μM 3个浓度进行试验。同时，CCK8实验结果表明，与HMCL组比较，Adriamycin组细胞增殖速度显著降低(P<0.01，图2)；与Adriamycin组比较，Adriam+TSⅡA(5 μM)组、Adriam+TSⅡA(10 μM)组和Adriam+TSⅡA(20 μM)组细胞增殖速度明显升高(P<0.05，P<0.01)，表明TSⅡA能减弱Adriam对HMCL细胞增殖的抑制作用(图2)。

图1 TSⅡA对HMCL细胞活性的影响

*:与HMCL组比较，P<0.01；#:与Adriamycin组比较，P<0.05;△:与Adriamycin组比较，P<0.01

2.2 TSⅡA对肾小球系膜细胞凋亡蛋白表达的影响

与HMCL组比较，Adriamycin组细胞Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，图3)；与Adriamycin组比较，Adriam+TSⅡA (5 μM) 组、Adriam+TSⅡA (10 μM) 组和Adriam+TSⅡA (20 μM)组细胞Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，图3)，表明TSⅡA能减弱Adriam诱导Caspase-3和Caspase-9表达的作用。

2.3 TSⅡA对肾小球系膜细胞凋亡的影响

流式细胞术试验结果表明，与HMCL组比较，HMCL组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.01，图4a)；Adriam+TSⅡA(5 μM) 组、Adriam+TSⅡA(10 μM)组和Adriam+TSⅡA(20 μM) 组细胞凋亡率均显著低于Adriamycin组，差异有统计学意义(P<0.05，图4c)；同时，Hoechst染色实验结果也表明，Adriamycin能显著升高HMCL细胞凋亡率，差异有统计学意义(P<0.01，图4b)，TSⅡA(5，10，20 μM) 能明显减弱Adriam促进HMCL细胞凋亡率升高的作用(P<0.05，图4d)，表明TSⅡA 能减弱Adriam诱导HMCL细胞凋亡的作用。

*:与HMCL组比较，P<0.01；△:与Adriamycin组比较，P<0.01

3 讨论

丹参是我国传统中药，现代常被用于冠心病、心肌缺血及慢性心功能衰竭等心血管疾病的治疗[11-12]。TSⅡA是从丹参中提取的一类脂溶性成分，也是丹参的主要有效成分之一。现代研究表明，TSⅡA能通过抗凋亡、抗炎、抗氧化等发挥对心、肾等器官的保护作用[13]。研究表明，TSⅡA能抑制肾近端小管间质纤维化，还能减轻慢性肾损伤大鼠的蛋白尿情况、降低大鼠血清肌酐的水平，从而减缓大鼠的肾损伤进程[14-15]，表明TSⅡA具有一定的肾保护作用。但其对慢性肾损伤中肾细胞凋亡的作用还未见报道。

Adriam是一类具有较好疗效的化疗药物，但由于其具有较强的副作用而限制了其应用。大量研究表明，Adriam的大量使用可造成心、肾等多种器官衰竭，使癌症患者出现严重的并发症[15-16]，因此，Adriam常被用于诱导慢性肾病动物模型。肾小球系膜细胞是肾小球滤膜的主要组成细胞，在维持肾小球结构和功能方面发挥着重要作用[17]。研究发现，TSⅡA能抑制Adriam诱导的心肌细胞凋亡[18]。TSⅡA还能通过抑制Adriam诱导的线粒体脂质过氧化减轻大鼠的心肌损伤[19]。王军建等[20]的研究发现，TSⅡA可通过影响肾组织Nephrin蛋白和肿瘤坏死因子β1的表达减轻Adriam诱导的肾损伤，提示TSⅡA具有肾保护作用。本研究中，我们采用Adriam处理人肾小球系膜细胞，复制慢性肾病的体外模型。同时，本文采用浓度梯度的TSⅡA处理肾小球系膜细胞并发现，当TSⅡA浓度高于50 μM时对HMCL细胞具有明显的细胞毒性，因此在后续实验中选择5，10，20 μM 3个浓度进行后续实验。采用CCK8法检测细胞增殖情况发现，Adriam能显著抑制HMCL细胞增殖，表明Adriam对HMCL细胞具有明显的细胞毒性。TSⅡA能显著减弱Adriam抑制HMCL增殖的作用，表明TSⅡA能减轻Adriam对肾小球系膜细胞的毒性，从而发挥肾保护作用。

a：流式细胞术检测细胞凋亡；b:Hoechst染色检测细胞凋亡；c:流式细胞术检测细胞凋亡结果的定量分析；d:Hoechst染色检测细胞凋亡结果的定量分析 *:与HMCL组比较，P<0.01；#:与Adriamycin组比较，P<0.05;△:与Adriamycin组比较，P<0.01

研究表明，肾小球系膜细胞大量死亡可导致肾小球滤膜渗透性改变、肾小球水肿及毛细血管破坏等，最终导致肾功能衰竭[21]。因此，抑制肾小球系膜细胞凋亡是治疗肾疾病的关键。研究发现，TSⅡA能对抗病毒引起的肾细胞的凋亡[22]。Hong等[23]研究发现，TSⅡA能通过抑制凋亡相关蛋白Caspase-3和细胞色素C的表达抑制Adriam诱导的心肌细胞凋亡。Caspase-3及其上游Caspase-9是细胞凋亡的最终执行者，凋亡基因可通过上调线粒体细胞色素C的表达，激活Caspase-9和Caspase-3，进而诱导细胞DNA降解，促进细胞凋亡[24]。在本研究中，我们采用流式细胞术和Hoechst染色同时检测了各组细胞的凋亡情况，结果显示，Adriam能明显促进肾小球系膜细胞凋亡，进一步表明Adriam具有肾毒性。TSⅡA能显著降低Adriam处理后HMCL细胞的凋亡率，表明TSⅡA具有抗肾小球系膜细胞凋亡的作用。此外，TSⅡA还能显著减弱Adriam对HMCL细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9表达的促进作用，进一步证明TSⅡA具有抗肾小球系膜细胞凋亡的作用。

综上所述，TSⅡA能减弱Adriam对肾小球系膜细胞HMCL增殖的抑制作用，抑制肾小球系膜细胞HMCL凋亡，并能降低HMCL细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9的蛋白质表达水平，表明TSⅡA能促进病理情况下肾小球系膜细胞增殖，通过调控凋亡蛋白的表达抑制细胞凋亡，提示TSⅡA可能通过抑制细胞凋亡减缓慢性肾病的病理进程。本研究首次探究了TSⅡA对Adriam诱导的肾小球系膜细胞凋亡的作用，但对于其具体作用机制还未进行探讨，因此将在之后的研究中针对其具体的信号通路进行探究。