藏獒犬链球菌的分离与鉴定

谭仕旦

摘要：从病死藏獒的病变器官组织中分离培养病原菌，根据細菌培养分离、染色、镜检、生化试验、药敏试验及核酸鉴定等方法确诊该病原菌为犬链球菌。药敏试验结果表明，该分离菌对头孢噻呋钠、罗红霉素、替米考星、氧氟沙星、林可霉素、氨苄西林等药物敏感，对多西环素中等敏感，对阿米卡星耐药。分离菌16S rRNA与犬链球菌（CG40）同源性达到99.2%。

关键词：藏獒；犬链球菌；分离；鉴定

中图分类号：S852.61+1；S858.292 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）17-0079-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.020 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The pathogenic bacteria from the dead bodies of the lesions in organs and tissues of tibetan mastiff was isolated and cultured， according to the diagnosis of bacterial isolation and culture， staining， microscopy， biochemical test， drug sensitive test and the results of 16S rRNA gene sequence analysis， the pathogenic bacteria was proved to be Streptococcus canis. The results of antibiotic susceptibility testing demonstrated that， the Streptococcus canis was highly sensitive to ceftiofur sodium， roxithromycin， tilmicosin， ofloxacin， lincomycin， ampicillin， medium sensitive to doxycycline， resistance to amikacin. Their 16S rRNA was closely related to Strephtococcus canis（CG40） with homologies of 99.2%.

Key words： tibetan mastiff； Streptococcus canis； isolation； identification

链球菌（Streptococcus）在自然界中分布广泛，种类繁多，依据C物质结构和特性抗体的沉淀反应，兰斯菲尔德（Lance-field）分类为20个群和若干血清型[1]。Devriese等[2]从乳房炎奶牛和感染犬中首次分离出犬链球菌（Streptococcus canis sp. nov.）。犬链球菌属于G群链球菌，DSM 20715菌株， G+C含量为39.5%，革兰氏阳性菌，常分布于犬、猫等多种动物的皮肤和黏膜上，在外界环境的不良刺激、机体抵抗力下降、皮肤和黏膜破损的情况下，感染犬、猫可引起败血症、关节炎等疾病；感染奶牛可引起奶牛乳房炎；感染人可引起人的败血症、脑膜炎等[3]。近年来，犬链球菌对犬、猫和人类的危害引起了人们的重视，国际兽疫局已将其确定为一种新的人兽共患病。Pesavento等[4]报道，美国加利福尼亚北部、南部以及北卡罗莱纳3个地区的猫收容所，在两年内先后暴发了犬链球菌感染，共有150多只猫感染发病，死亡率高达30%。Galperine等[5]报道犬链球菌感染人导致败血症死亡。

随着人们生活水平的提高，宠物行业快速发展，伴侣动物日益增多，藏獒已成为很多人喜欢的犬种，但目前国内鲜见关于藏獒犬链球菌病的报道。2017年，湖北恩施某藏獒养殖基地发生疑似犬链球菌病，造成了严重的经济损失。现将该病的微生物学诊断结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源

在实验室相对无菌的环境下，对病死藏獒进行尸体病理剖检。剖开腹腔，取出肝脏、脾脏、肾脏、肠系膜淋巴结，剖开胸腔取出肺脏、心脏，打开颅腔，取其脑髓，观察记录各器官的病理变化。然后采集脾脏、肾脏、肝脏、淋巴结、心脏等病变明显的部位作为病料。

1.2 主要试剂

10%新生胎牛血清肉汤培养基，自制，所用的胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。

LB基础培养基，自制，配方采用胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、食盐10 g，摇动容器直至溶质溶解。用5 mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1 L。高压蒸汽灭菌21 min。

Thermus aquaticus DNA聚合酶（Taq buffer）、DNA混合物（dNTPs）、胶回收试剂盒、pMD18-T Vector载体、DL 2000 DNA Marker，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

细菌特殊化试验鉴定管购于杭州天和微生物试剂公司；细菌药敏试纸购于广州市益满生物科技有限公司。

1.3 细菌分离与纯化培养

在微生物实验室相对无菌的条件下进行病料细菌的分离与纯化培养。操作过程按常规要求无菌操作，用消毒好的手术刀切开病变组织器官，将病变组织切口触压在10%新生胎牛血清肉汤培养基上，在37 ℃的条件下倒置培养24 h，观察记录菌落的生长情况，然后选取长势好、形态特征典型一致的优势菌落在相同的条件下作纯化培养。

1.4 细菌染色镜检

病料组织中的病原菌经分离培养后，选取典型菌落经过纯化培养，所长出的菌落形态一致，挑取菌落进行涂片，适当加热固定，用革兰氏染液进行染色，油镜下观察细菌的形态。

1.5 生化鉴定和耐药性试验

将分离到的单个细菌在含有10%新生胎牛血清的营养琼脂板上重新划线培养，进行细菌的生化试验和耐药性试验。

1.6 细菌16S rRNA鉴定

细菌核酸的提取，在100 ℃条件下煮沸裂解细菌，并提取细菌全部脱氧核糖核酸。操作过程为取纯化培养的单个菌落加入到10%新生胎牛血清肉汤培养基中，在37 ℃的条件下，200 r/min摇床培养6～8 h，5 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀用100 μL去离子水重悬，然后煮沸10 min，冷却至室温后，10 000 r/min离心1 min，取上清液作DNA模板，于-20 ℃保存备用。

细菌16S rRNA通用引物的设计按照NCBI犬链球菌特异片段16S rRNA基因设计合成一段特异引物[6]，上游引物PA（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）和下游引物PB（5′-AGGAGGTGATCCAGCC

GCA-3′），对细菌核酸进行PCR扩增，反应体系和条件为：10×Taq buffer 5 μL，dNTPs Mixure 4 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用去離子水补足至50 μL。聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）操作方法为预变性温度94 ℃，时间4 min；变性温度94 ℃，时长 1 min，退火降温至55 ℃，时长1 min，升温至72 ℃，延伸1 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。利用胶回收试剂盒对预期片段（1 400 bp左右）进行回收，用1%的琼脂糖凝胶进行验证，将提纯的目的片段与pMD18-T载体连接，转入感受态的大肠杆菌内，涂布在LB基础培养基上，培养过夜，选取阳性克隆增殖培养，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定。

2 结果与分析

2.1 临床检查和病理剖检结果

该病临床发病较慢，散发型，初期精神不振，食欲减退，似感冒，中后期体温升高到40～42 ℃，心跳加快，100次/min以上，脉博节律不齐，呼吸困难，腹部息痨沟明显，呈犬坐姿势，结膜充血，皮肤充血、淤血、败血症反应。食欲废绝，后肢无力，不愿活动，继而出现麻痹、痉挛等神经症状，最后抽搐死亡，病程5～10 d。尸体病理剖检可见肺淤血、出血，呈大叶性肺炎病变；心包腔积聚少量液体，心外膜下冠状沟处有散在出血点，左右心室肌柔软，心室腔外积有多量血液；肝脏肿大，呈暗褐色，胆囊胀满。肾脏轻度肿大，表面有散在出血点、坏死灶，膀胱颈黏膜有少量出血点；脾脏轻度肿大，边缘增厚有淤血、出血性坏死灶。

2.2 细菌培养及革兰染色结果

细菌分离纯化培养的菌落呈灰白色半透明、细小如露珠状、表面光滑且湿润黏稠，边缘整齐的圆形或卵圆形，直径0.1～1.0 mm，并有宽而典型的β溶血环。取菌落做涂片，革兰氏染色，在1 600倍油镜下观察细菌呈紫色，为革兰阳性球菌，菌体较小，有单个存在的，也有成对或链状排列的。

2.3 细菌的生化试验结果

该菌的生化试验结果见表1。

2.4 药物敏感试验

药物敏感试验结果见表2。从表2可以看出，该病料分离出的病原菌对头孢噻呋钠、罗红霉素、替米考星、氧氟沙星、林可霉素、氨苄西林等抗菌药物敏感，对多西环素中等敏感，对阿米卡星耐药。

2.5 细菌16S rRNA鉴定

在1%的琼脂糖凝胶上可以明显看到，在预期片段1 400 bp左右有较亮的目的条带（图1）。对该片段进行回收和测序，序列经Blast程序搜索与基因库CG40序列比对，该分离菌与犬链球菌的同源性达到99.2%。

通过以上临床检查、细菌分离培养与镜检、细菌生化试验、细菌药敏试验、细菌PCR鉴别的结果，确定该病原体为犬链球菌。

3 小结

本次藏獒发病后，经临床检查、尸体病理解剖，疑似犬链球菌病，然后将尸体病变组织中的细菌进行分离培养、细菌染色镜检、细菌生化鉴别试验、细菌药物敏感试验和细菌PCR鉴定，试验研究结果确定病原体为犬链球菌，准确诊断该病为藏獒犬链球菌病。药敏试验结果表明，犬链球菌对头孢噻呋钠、罗红霉素、替米考星、氧氟沙星、林可霉素、氨苄西林等抗菌药物敏感。近年来，国内外相关资料报道了犬链球菌感染犬、猫、奶牛和人，但犬链球菌感染藏獒发病的报道很少见，本次藏獒犬链球菌病的研究结果，为更好地预防和治疗该病提供了科学的参考依据。试验结果与齐凯歌等[7]关于狐源犬链球菌的分离鉴定结果基本一致，下一步还将对该犬链球菌的致病性和流行病学作进一步研究。

参考文献：

[1] 孔宪刚. 兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2013.

[2] DEVRIESE L A，HOMMEZ J，KILPPER-BALZ R，et al. Streptococcus canis sp. nov.：a species of group G streptococci from animals[J].Int J Syst Baceriol，1993，36（3）：422-425.

[3] 赵 婷，马 良，田克恭.犬链球菌感染研究进展[J].中国兽医杂志，2010，46（9）：56-58.

[4] PESAVENTO P A，BANNASCH M J，BACHMANN R，et al. Fatal Streptococcus canis infections in intensively housed shelter cats[J].Vet Pathol，2007，44（2）：218-221.

[5] GALPERINE T，CAZORLA C，BLANCHARD E，et al. Streptococcus canis infections in humans： Retrospective study of 54 patients[J].J Infect，2007，55（1）：23-26.

[6] DUGA S，GOBBI A，ASSELTA R，et al. Analysis of the 16S rRNA gene sequence of the coryneform bacterium associated with hyperkeratotic dermatitis of athymic nude mice and development of a PCR-based detection assay[J].Mol Cell Probes，1998， 12（4）：191-199.

[7] 齐凯歌，薛 原，孙 萌，等.狐源犬链球菌的分离鉴定[J].畜牧与兽医，2017，49（8）：93-97.