市售酸奶中乳酸菌的抗氧化和耐酸耐胆盐能力分析

姚沛琳，苏 博，徐礼生，张兴桃，高贵珍

宿州学院生物与食品工程学院，宿州，234000

乳酸菌不仅具有抗癌抗衰老、降低胆固醇、增强机体免疫力、缓解乳糖不耐症等功效，还能赋予发酵制品特殊的风味[1]，因此常用于发酵食品中。活菌型酸奶相对于常温酸奶，不同点在于产品中有活菌的存在，而活菌的数量和菌株的性能是该类产品质量的关键[2]。根据我国相应的国家标准[3]，活菌型酸奶中的活菌必须达到一定数量才能在人体发挥功效，我国国家标准规定酸奶中活菌的含量应达到1×106cfu/mL。活性乳酸菌必须顺利通过复杂的人体消化系统和极端的胃肠道环境，才能在人体真正发挥益生作用[4]。

近年来，一些活菌型酸奶因独特的口感和所宣传的益生功效为人们所喜爱。研究表明，酸奶中使用的菌株多数具有较好的耐酸耐胆盐性能和抗氧化能力[5-7]。在购买行为上，消费者更易受广告宣传的诱导。但并不是所有酸奶都具有所宣传的效果，酸奶中添加的菌株是否能够在人体发挥有益作用，有待进一步研究[8]。

为了探讨活菌型酸奶中所含菌株能否在人体消化系统中存活以及是否具有抗氧化能力，本文以市售6种常见品牌旗下9款活菌性酸奶为研究对象，从中分离纯化得到乳酸菌菌株，通过消除自由基等实验分析菌株的抗氧化能力，通过耐酸耐胆盐性实验测定菌株对酸和胆盐的耐受性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料与试剂：酸奶选自宿州市大润发超市中售卖的6个品牌旗下9款酸奶(4 ℃下保存)：卫岗风味酸奶、蒙牛优益C、养乐多、君乐宝纯享、伊利pureDay、蒙牛冠益乳、君乐宝每日活菌、伊利life up、光明畅优；MRS肉汤培养基；二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、丙三醇、猪胆盐、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸等，均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

仪器：LDZX-50KBS高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；WT-2ND超净工作台(北京玉堂蓝翼科技有限公司)；SHP-400电热恒温培养箱(上海三发科学仪器有限公司)；721G可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；H1850台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化

根据文献[9-11]中方法，将9款酸奶样品分别进行10×梯度稀释，选择适宜的稀释度，涂布于MRS固体平板上，培养48 h后观察结果。从平板上挑取单个形态不同的可疑菌落进行涂片、革兰氏染色并镜检，选择G+菌且无芽孢的菌株在MRS琼脂平板上多次划线。挑取纯化后的单菌落，将其接入MRS肉汤培养基内进行增菌，收集对数期的菌体，以甘油为保护剂，置于-40 ℃冷冻室内进行菌种保藏。

1.2.2 菌株的抗氧化能力实验

从保菌管中取出1 mL菌液置于MRS肉汤培养基中，连续活化3代，将活化好的菌液在8 000 r/min下离心15 min，收集上清液即为实验所需发酵液。

1.2.2.1测定菌株的DPPH·自由基清除能力

结合文献中方法[12-14]，并加以改进。取样品2.0 mL，加入95%乙醇2.0 mL，混匀后再加入2.0 mL浓度为0.2 mmol/LDPPH溶液于试管中摇匀，避光放置60 min后，于3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，用95%乙醇作参比，测定其吸光度A1。同时把2 mL的0.2 mmol/L DPPH溶液与2 mL的95%乙醇混合，以PBS缓冲液代替样品，测其吸光度A2。把1 mL的MRS肉汤培养基与2 mL的95%乙醇混合，再加入DPPH溶液，反应后在517 nm处测吸光度A3。

DPPH·自由基清除率用下式表示：

清除率=(A3-A1)/A2×100%

1.2.2.2 测定菌株的羟自由基(HO·)清除能力

结合文献中方法[15]，并加以改进。将2 mL的6 mmol/L硫酸亚铁溶液与2 mL的6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液混合后，加入2 mL的20 mmol/L的过氧化氢溶液进行反应，再加入2 mL样品，37 ℃恒温水浴1 h，于3 000 r/min下离心10 min。冷却15 min后取上清液，在510 nm处测定吸光值A1。用双蒸水取代样品，测定吸光值A2，用MRS肉汤培养基取代样品，测定吸光度A3。

HO·清除率用下式表示：

清除率=(A3-A1)/A2×100%

1.2.2.3 测定菌株的还原性

根据文献中方法[16]，将1 mL样品与1 mL的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH7)混合，再加入1 mL的1%的铁氰化钾溶液。混匀后于50 ℃下水浴20 min，冷却后加入2.0 mL的10%的三氯乙酸，4 000 r/min离心10 min，取2 mL上清液，和2 mL的0.1%三氯化铁溶液反应后，在700 nm处测吸光度。吸光度越高，说明反应混合物所对应的菌体的还原性越强，样品的总抗氧化能力越高。

1.2.2.4 菌株耐酸性实验

根据文献中方法[17]，将活化好的菌株以2%的量分别接种于pH值为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0的MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，测定各组菌液的OD600值。

1.2.2.5 菌株的耐胆盐实验

根据文献中方法[18]，将活化好的菌株以2%的量分别接种于猪胆盐浓度为0，0.3，0.5，0.7 g/L的MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，测定各组菌液的OD600值。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌分离结果

使用加有指示剂溴甲酚紫的MRS固体培养基，挑选能使培养基颜色变黄的乳白色或乳黄色，边缘齐整，表面凸起或扁平的典型单菌落[19]，同时过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性菌，初步确定从9款酸奶中分离出17种乳杆菌，其菌落形态及细胞特征如表1所示。

表1 乳酸菌菌落形态及细胞特征

2.2 菌株的抗氧化实验结果

2.2.1 菌株的DPPH·自由基清除能力

DPPH·自由基是一种常见的稳定的有机自由基，对人体器官具有极强的损害作用，常用于体外抗氧化实验的研究。其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm处有强吸光性，当自由基清除剂加入DPPH溶液时，肉眼可见紫色变浅或消退，在517 nm处吸光性减弱[20]。本实验通过这一特性检测菌株的抗氧化能力，结果如图1所示。

图1 不同菌株对DPPH·自由基的清除能力

由图1可知，17株菌株对DPPH·自由基具有不同程度的清除能力，清除率均在25%以上。各菌株清除率相差较大，清除率最高的是分离自伊利PureDay 酸奶中的15号菌株，清除率高达39.86%。清除率最低的是分离自养乐多的4号菌株，清除率仅有28.02%。

2.2.2 菌株的HO·自由基清除能力

羟自由基具有很强的氧化性，对生物细胞大分子有较大的损害作用[21]。本实验通过这一特性检测菌株的抗氧化能力，结果如图2所示。17株菌株对羟基自由基具有不同程度的清除率，清除率在37%～48%之间。各组菌株清除率相差不大，清除率最高的是分离自养乐多的4号菌株，清除率高达47.83%。清除能力最低的是分离自光明畅优的14号菌株，清除率仅有37.68%。

图2 不同菌株对HO·自由基的清除能力

2.2.3 菌株的还原能力

菌株的还原能力与其所含有的抗氧化剂息息相关，还原能力越强，清除自由基效率越高，抗氧化性就越强[21]。本实验利用这一特性测定不同菌株的还原能力，所测的值为样品稀释2倍后的结果，如图3所示。

由图3可知，除1号与2号菌株还原能力相对较弱以外， 其他15种菌株的还原能力均较强，总抗氧化能力较强。

图3 不同菌株的还原能力

2.2.4 菌株的耐酸性实验结果

人体胃液的pH值约为2～3，在体外有较好益生作用的乳酸菌必须能顺利通过胃液极端的酸性环境，才能在体内发挥益生作用[4,22]。为了探讨从酸奶中分离出的菌株的耐酸性，设立了pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7 6个不同的生长环境，37 ℃培养16 h后测定其吸光值，吸光值越高，证明菌株的耐酸性越强。结果如图4所示。

图4 耐酸实验结果

由图4可知，除4、7、10号菌株对酸性极为不耐受外，各菌株的最适pH值均为6。随着pH值的降低，各菌株均减缓甚至停止生长。由此可得知，菌株在人体胃液环境下几乎没有活性。

2.2.5 菌株的耐胆盐实验结果

乳酸菌除了需要经受人体极端的酸性环境的考验，还需要经受人体消化道的高胆盐环境的考验。为了探讨从酸奶中分离出的菌株的耐胆盐能力，设立了4个不同的胆盐浓度，分别为0 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L和0.7 g/L，37 ℃培养16 h后测定其吸光值，吸光值越高，证明菌株的耐胆盐能力越强。结果如图5所示。

由图5可知，在无胆盐环境下各项菌株活性最大，随着胆盐浓度的增加，菌株活性逐渐减弱，在0.5 g/L和0.7 g/L胆盐浓度下几乎不生长。人体胆盐浓度一般为0.3 g/L，除了4、7、10号菌株对胆盐耐受能力较低外，其他各菌株对胆盐的耐受性较好。

图5 耐胆盐实验结果

3 结 语

酸奶属于乳酸菌发酵型制品，乳酸菌菌株及其代谢产物可以促进肠道蠕动，改善人体消化功能，但乳酸菌能够充分发挥益生作用的前提是可以大量、有活性地通过人体肠道[22-23]。由上述实验结果可知，从市售酸奶中分离出的乳酸菌菌株，对酸性环境不耐受，即使是耐酸性较强的嗜酸乳杆菌，在pH2～3的条件下也几乎不存在活性，在人体肠胃的酸性条件下不能很好地发挥作用。在耐胆盐实验中，绝大多数菌株表现出较好的耐胆盐能力，对人体胃肠道中的胆盐具有耐受性。

由抗氧化结果可知，菌株的DPPH·自由基清除能力、HO·自由基的清除能力和还原能力有较大差异，其中前两项差别较大。同一株乳酸菌在三种不同的抗氧化实验中进行测定，所得出的结果也不相同。可能是因为不同乳酸菌中抗氧化作用的活性物质不同，同种乳酸菌对不同物质的清除的机制不同。但总体来说，各菌株抗氧化能力均较强。

综上所述，市售酸奶所选用的菌种总体性能良好，抗氧化能力与耐胆盐性较强，但对酸性环境的耐受性不强，还需要进一步开发对酸性环境有较好耐受性的优良菌株。