9个杜鹃品种的高温半致死温度与耐热性评价

刘婉迪，王 威，谢 倩，陈清西

温度是影响植物生长发育的重要因素，不适宜的温度极易影响植物的生理代谢，由于细胞膜对温度有较高的灵敏性［1］，过高的温度会造成细胞膜组织结构性损伤［2］。J.K.Raison［3］等提出膜脂相变理论后，许多研究证明原生质膜透性的变化主要在于质膜的变化［4-5］。因此，通过测定植物组织电解质外渗率变化情况，可以判断植物是否受到高温胁迫以及胁迫程度。电导法配合Logistic方程计算植物高温半致死温度(LT50)的测定方法简便、灵敏，已应用于马铃薯［6-7］、油茶［8］、紫花苜蓿［9］、景天植物［10］、梨［11-12］、菊花［13］、白杨［14］、核桃［15］等多种植物材料，认为其能够准确地对植物耐寒和耐热性作出正确的判断。杜鹃(Rhododendron)是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃属的常绿花灌［16］。杜鹃品种繁多、花色丰富，具有较高的观赏与经济价值，其生长适宜温度为12～25℃，多分布于较高海拔地区。目前栽培的大多数杜鹃优良品种的耐热性较差，温度超过35℃时，新梢和新叶生长缓慢，进入半休眠状态［17］，夏季高温成为制约其生长发育的主要环境因子。福建省夏季炎热潮湿，最高气温可达40℃，限制了大量优良杜鹃品种在园林绿化中的应用。因此，筛选和选育耐热杜鹃品种，对于扩大其在园林绿化的应用具有重要意义。本研究通过在福建省多个地区调查，选择9个福建地区畅销的杜鹃品种进行高温胁迫处理，利用电导法配合Logistic方程，求得高温半致死温度(LT50)、细胞伤害率，而后结合人工气候箱模拟高温胁迫观察这些品种的表型变化、计算相应的褐变指数，对其进行正确性验证，从而对9个品种杜鹃进行耐热排序，筛选出较适宜在福建地区园林绿化中应用的耐热品种，为生产应用提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

9个供试杜鹃品种(图 1)，由永根杜鹃花培育有限公司提供。试验于2016年3月在福建农林大学园艺设施温室内进行。挑选4年生扦插苗，栽植于塑料花盆中(长×宽×高为20 cm×20 cm×30 cm)，于温室中适应性栽培3个月后，选取长势一致、无病虫害的植株进行试验。

1.2 方法

1.2.1 细胞伤害率与高温半致死温度的测定与计算 细胞伤害率的测定参照岑维亚［18］的方法。处理温度与细胞伤害率用Logistic方程:y=k/(1+ae－bt)拟合，方程中y代表细胞伤害率，t代表处理温度，k，a，b为方程参数，k为细胞伤害率的饱和容量，b表示x与y之间的函数关系，a反映方程曲线与原点之间的相对位置关系［19］。为了确定a、b的值，将Logistic方程:y=k/(1+ae－bt)进行线性化转化处理，ln［(k－y)/y］=lna－bt，令 y1=ln［(k－ y)/y］，则转化为细胞伤害率(y1)与处理温度(t)的直线方程。求回归方程的二阶导数，并令其等于零，即可获得曲线拐点d2y/d2x的x值，即 ln a/b，其值为高温半致死温度(LT50，℃)。

1.2.2 高温胁迫条件下表型指标的观测 将上述盆栽扦插苗置于人工气候箱中，胁迫温度为50℃(昼/夜)，光照强度为 150 μmol·m－2·s－1，每个处理3株，重复3次。相对湿度90%～95%，连续处理直至所有植株叶片枯萎，每12 h拍照和统计数据。胁迫期间时刻关注土壤水分的变化，及时浇水，防止干旱导致的胁迫，影响数据真实性。根据李英慧［20］的方法稍作改变计算叶片褐变指数，将叶片的褐变状态分为6级(表1)。统计褐变指数=［∑(褐变级值×相应褐变级值株数)/(总株数×褐变最高级值)×100%］。

1.2.3 统计分析法 利用 SPSS 19.0和 Graphpad prism7.0软件进行试验数据的统计与聚类分析，数值均以平均值±标准差表示。统计方法采用Duncans New Multiple Range test(P＜0.05)和 One-Way ANOVA。

2 结果与分析

2.1 叶片细胞伤害率与胁迫温度的关系

当植物受到胁迫时，叶片细胞膜遭到破坏、电解质外渗，导致植物细胞浸提液的电导率增大。一般认为植物耐热性与高温胁迫后细胞浸提液的电导率呈负相关。在不同温度处理条件下，随着温度的升高，9个品种叶片的伤害率呈现“缓慢增加-急剧增加-缓慢增加”的趋势，即典型的“S”形曲线。

图1 9个参试杜鹃品种表型Fig.1 Morphological characteristics of 9 Rhododendron cultivars

表1 杜鹃叶片褐变指数分级Table 1 Grades of leaf browning index of Rhododendron

在40～45℃区间内，9个杜鹃品种的细胞伤害率增加缓慢，表明此温度区间内，杜鹃叶片能自主调节并且维持细胞稳定;在45～50℃温度区间时，9个品种的相对电导率均呈现快速上升趋势，其中‘霞红’的增幅最大为 96.75%，‘天章’的增幅最小(39.16%)。‘御代之荣’和‘霞红’在50℃水浴处理后，细胞伤害率达到 90%以上;‘白丹麦’、‘粉五宝’、‘春诗’和‘大青莲’在55℃时，细胞伤害率达到90%以上;而‘石岩’、‘琉球红’和‘天章’在60℃时，细胞伤害率达到90%以上(图2)。

图2 杜鹃各品种细胞伤害率与处理温度间的关系Fig.2 Relationships between cell injured rate treatment and temperature in Rhododendron cultivars

2.2 高温半致死温度的确定

计算得出的9个杜鹃品种的转化细胞伤害率和处理温度间的关系见图3。可以看出，杜鹃在不同温度(t)下的细胞转化伤害率(y1)的分布趋近一条直线(P＜0.01)，说明 y1与 t之间的关系用Logistic方程是合适的。高温半致死温度与杜鹃耐热性呈正相关，9个品种的高温半致死温度范围在46～54℃，耐热性排序依次为:‘石岩’＞‘琉球红’＞‘白丹麦’＞‘天章’＞‘春诗’＞‘大青莲’＞‘粉五宝’＞‘御代之荣’＞‘霞红’。其中高温半致死温度最高的品种为‘石岩’，53.84℃，最低的品种为‘霞红’，46.92℃，与‘石岩’相差7℃左右，具有较明显的差异(表2)。

图3 杜鹃各品种转化细胞伤害率与处理温度间的关系Fig.3 Relationship between converted rate of injured cells and treatment temperature in Rhododendron cultivars

表2 杜鹃各品种高温下相对电导率回归方程及高温半致死温度(LT50)Table 2 Logistic equations of relative electrolyte leakage and their high semi-lethal temperature(LT50)of Rhododendron cultivars

2.3 高温胁迫时长对杜鹃各品种叶片褐变指数和表型的影响

不同品种在一定时间范围内随着高温胁迫时间的延长，叶片褐变指数呈上升的趋势，在12 h胁迫后，‘霞红’大约50%左右叶片完全枯萎。当胁迫时间达到24 h时，‘霞红’完全死亡，其他8个品种叶片均遭受不同程度的损伤，叶片逐渐由Ⅲ级损伤向Ⅳ级和Ⅴ级损伤转变。当胁迫时间达到24 h时，‘大青莲’、‘粉五宝’和‘御代之荣’完全死亡，剩余6个品种叶片大多处于Ⅴ级褐变状态。当36 h胁迫后，‘天章’、‘白丹麦’和‘春诗’全部死亡，‘石岩’和‘琉球红’均处于Ⅴ级和Ⅵ级胁迫状态。当48 h胁迫后，‘石岩’和‘琉球红’完全死亡。通过褐变指数以及表型变化可对供试品种的耐热性进行排序:‘石岩’＞‘琉球红’＞‘天章’＞‘白丹麦’＞‘春诗’＞‘大青莲’＞‘粉五宝’＞‘御代之荣’＞‘霞红’。结合褐变指数可知，一定的高温处理下，随着高温胁迫时间的增长，供试各品种叶片对高温抵抗能力不同，说明不同杜鹃品种叶片细胞膜对高温胁迫的反应有差异，对高温伤害的响应不同;同一品种随着处理时间的延长，叶片的褐变指数逐渐上升，但上升速度有不同，表明高温对其的伤害有一个跃变过程(图4、图5)。

2.4 不同品种耐热性的聚类分析

将9个杜鹃品种的高温半致死温度和褐变指数数据经标准化转换后，采用平方欧氏距离，用离差平方和法对杜鹃不同品种的耐热性进行了系统聚类分析(图6)，在欧式距离2.50处可将9个品种分为3类，第Ⅰ类群包括:‘石岩杜鹃’、‘琉球红’为强耐热品种，平均半致死温度为53.28℃;第Ⅱ类包括:‘天章’、‘春诗’、‘白丹麦’和‘大青莲’为中等耐热品种，平均半致死温度为51.49℃;第Ⅲ类包括:‘粉五宝’、‘御代之荣’和‘霞红’，平均半致死温度为47.60℃。

3 结论与讨论

图5 高温胁迫时长对杜鹃各品种表型的影响Fig.5 Effects of different heat treatment time on morphological characteristics in Rhododendron cultivars

图6 杜鹃各品种的耐热性聚类分析Fig.6 Cluster analysis of heat tolerance in Rhododendron cultivars

逆境胁迫导致植物细胞质膜选择性丧失，电解质和某些有机物大量渗漏［21］。植物细胞膜的稳定性是其抗逆性鉴定的重要指标，有研究表明高温胁迫下的植物变异与其本身的表现一致［12］。以细胞伤害率拟合Logistic方程计算得到的高温半致死温度(LT50)可较准确地反映植物的耐热性差异［22］，该方法简单准确，已有效地在多个植物中得到证实［5，22-25］。但是王文举［26］等认为由于半致死温度和细胞伤害率是在离体条件下测定的，不一定能确切反映出植物的耐热性。因此，本试验通过采用人工气候箱集中高温胁迫观测9个品种的表型以及比较叶片的褐变指数进一步对9个品种的耐热性进行排序，以期验证高温半致死温度对杜鹃耐热性排序的准确性。研究表明，高温胁迫后杜鹃的细胞伤害率曲线呈现“S”形，通过显著性检验，符合Logistic方程。高温半致死温度在褐变指数的验证下，能客观反映杜鹃品种的耐热性，且所得到的耐热性排序与半致死温度排序一致，说明通过计算高温半致死温度来判断杜鹃的耐热能力差异是有效的。通过对高温半致死温度以及对人工气候箱的表型分析相结合，可以较为合理的为杜鹃的耐热性育种及其在福建低海拔地区的应用提供理论依据。其中‘石岩’和‘琉球红’具有较强的耐热性，可以尝试应用于福建地区的园林绿化中。

随着胁迫温度的增加，胞质外渗非持续进行，外渗电导值变化在总趋势升高的基础上有变缓或急剧增加的情况［27］。本试验中，9个品种杜鹃在40℃和45℃时，其细胞伤害率值变缓或下降，是植物在逆境伤害初期的自我保护作用，这时细胞膜的损伤是可逆的，可以通过自主调节维持细胞膜的稳定性进行主动运输，从而调整胞质的外渗，导致外渗电导值变缓或下降。但通过对测定品种叶片的电导值变化幅度可见，这种自我保护在不同杜鹃品种上表现不同，与不同品种的细胞对高温的应激反应的不同有关［11］。与张文娟［10］等对景天植物的耐热性的研究以及石永红［5］等对黑麦草的耐热性的研究中一致。而当超过一定温度范围时，供试杜鹃的细胞膜受到严重损伤，细胞膜可逆的损伤开始向不可逆的损伤转变［26］。且不同品种的杜鹃细胞伤害率急剧增加的转折点均不同。在50℃和55℃胁迫后，9个品种的细胞伤害率均呈现缓慢增加或保持不变的趋势，说明此时质膜已经遭到破坏，主动运输功能完全丧失，电导值下降。

综上所述，高温下，随着高温胁迫时间的增长，供试各品种叶片对高温抵抗能力不同，且温度对其伤害有一个跃变过程。褐变指数所得出的耐热性与高温半致死温度所得到的耐热性基本一致，说明高温半致死温度可以作为评价杜鹃耐热性的准确方法。根据高温半致死温度和褐变指数对杜鹃的耐热性进行系统聚类分析，9个品种可分为3类，第Ⅰ类群包括:‘石岩’、‘琉球红’为强耐热品种;第Ⅱ类包括:‘天章’、‘春诗’、‘白丹麦’和‘大青莲’为中等耐热品种;第Ⅲ类包括:‘粉五宝’、‘御代之荣’和‘霞红’为不耐热品种。