家兔肌肉组织miRNA Solexa测序与生物信息学分析

张翔宇 邝良德 李丛艳 张翠霞 郑洁 杨超 任永军 郭志强 唐丽 邓晓东 雷岷 黄邓萍 谢晓红

摘要：miRNA是一类长度约22 bp的小分子非编码RNA，在骨骼肌生长和肌细胞分化过程中起着重要的调控作用。利用Solexa测序技术对3只84日龄成年公兔的腿肌进行了miRNA测序，旨在评估高通量测序在发掘家兔miRNA中的数据质量以及解析家兔肌肉组织中miRNA的生物学特征。结果表明，除前4位碱基的错误率略高于0.5%外，其他位置的碱基错误率均低于0.5%，说明测序质量好、可信度高，获得的序列可用于后续miRNA的鉴定分析。纯净序列中其他类型RNA的比例仅占2.07%。肉兔肌肉中18～24 nt的小RNA首位碱基以U为主，其次为碱基A，具有很强的偏向性。miRNA序列长度主要分布在20～24 nt范围内，占纯净序列的90%以上。miRNA长度分布的不平衡和首位碱基的偏向性可能与miRNA的作用机理和具体生物学功能有关。

关键词：家兔；肌肉；高通量测序；miRNA

中图分类号：S829.1 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）16-0097-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.023 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Solexa Sequencing and Bioinformatics Analysis on miRNA from Rabbit Muscle

ZHANG Xiang-yu，KUANG Liang-de，LI Cong-yan，ZHANG Cui-xia，ZHENG Jie，YANG Chao，REN Yong-jun，

GUO Zhi-qiang，TANG Li，DENG Xiao-dong，LEI Min，HUANG Deng-ping，XIE Xiao-hong

（Sichuan Animal Science Academy/Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding in Sichuan Province，Chengdu 610066， China）

Abstract： miRNA as a kind of micromolecule non-coding RNA with the length of about 22 bp plays an important regulatory role in skeletal muscle growth and muscle cell differentiation. This research uses Solexa sequencing technology to conduct miRNA sequencing on three eight-four-day-old adult male rabbits， aiming at evaluating the quality of high-throughput sequencing in meat-rabbit miRNA data mining， and exploring the biological characteristics of miRNA in meat-rabbit muscular tissues. Results show that， except for bases in first three positions with an error rate slightly higher than 0.5%， bases in other positions have an error rate of lower than 0.5%， which indicates good sequencing quality， high reliability， and the applicability of obtained sequence in subsequent miRNA identification and analysis. Other types of RNA in pure sequences only take up 2.07%. The 18～24 nt small RNA first base in meat-rabbit muscle is mainly U base， and A base for the second with strong directivity. miRNA sequence length is mainly within the range of 20～24 nt， which takes up more than 90% of pure sequences. miRNA sequence length imbalance and the directivity of first-place base may be related to the action mechanism and specific functions of miRNA.

Key words： rabbit； muscle； high throughput sequencing； miRNA

家兔是節粮型食草小家畜，也是重要的人类肉食来源之一，还是许多人类疾病研究的理想动物模型。过去30年间，世界各国对家兔生长速度和肉质的遗传改良，已获得较大研究进展。欧洲的兔业发达国家已选育出齐卡（ZIKA）、伊拉（HYLA）和伊普吕（ELCO）等具有优良生长性能和肉用性能的肉兔配套系[1]。随着经济的发展和消费观念的改变，如何进一步提高兔肉产量和品质成为各国肉兔育种公司共同关注的焦点问题。对家兔肌肉生长发育机制认识的不足，尤其是对重要的调控因子及其作用机理知之甚少，极大地限制了家兔产肉性能的进一步提高。研究表明，miRNA作为一类新的肌肉调控因子在肌肉的生长发育中起着重要的调节作用[2，3]。miRNA几乎参与了肌肉细胞增殖和分化的所有过程，通过对各个时期关键因子的靶向作用，调控骨骼肌的发育[4]。高通量测序技术能够发掘和鉴定某一物种转录组水平的miRNA，具有检测速度快、成本低、覆盖深度广、信息量大的特点，是发掘和鉴定miRNA的有效工具[5]。与重点研究某一个或某一类转录子的传统方法相比，高通量测序技术能够从全基因组水平揭示转录组。目前利用该技术已经对家蚕[6]、鸡[7]、血吸虫[8]、果蝇[9]和线虫[10]等不同物种的miRNA进行了成功的发掘。与其他家畜相比，家兔miRNA的研究极为有限，而利用高通量测序技术进行家兔肌肉中miRNA鉴定的研究还未见报道，这将极大地限制全面、深入地理解miRNA在家兔肌肉生长发育过程中的作用。同时，也对高通量测序技术在家兔肌肉中miRNA的检测效果的评价提出了挑战。本研究利用Solexa高通量测序平台对新西兰白兔肌肉中的miRNA进行了系统地鉴定，旨在为高通量测序技术在家兔肌肉中检测miRNA的效果和效率评估提供可靠数据，也为深入揭示miRNA在家兔肌肉发育过程中的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验兔饲养于四川省畜牧科学研究院种兔场，选取同一天出生并在同一饲养管理条件下生长的84日龄新西兰白兔3只（公兔）。屠宰后迅速采集腿肌，装入无RNasee的离心管中，立即放入液氮中进行保存。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取 采用TRIZOL R Reagent（Invitrogen，San Diego，CA，USA）试剂盒进行总RNA的提取，具体步骤参照试剂盒的操作指南。取1 μL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳（1%）检测，在180 V的电压下电泳5 min，初步判断样品是否降解或污染，并简单鉴定RNA的完整性。检测合格的肌肉RNA样品送至北京诺禾致源科技有限公司进行测序。

1.2.2 Small RNA文库的制备与测序 每个样品取3 μg总RNA按照Illumina Tru SeqTM RNA Sample Preparation Kit（Illumina，San Diego，USA）的操作说明选取不同的index标签建库。文库质量达到要求后，使用Tru Seq PE Cluster Kit v3-c Bot-HS（Illumina）试剂在cBot上生成簇。然后在Hiseq 2000测序平台上进行单末端测序，得到50 bp的单端测序reads。

1.3 测序数据的质量控制

测序得到的原始序列（raw reads）以fastq格式保存，为了提高测序的质量，需要对原始序列去除其中的低质量reads、有接头污染reads或没有插入片段的reads、包含poly A/T/G/C的reads，最后获得到过滤后干净的序列（clean reads）。筛选一定长度区间范围内的clean reads进行长度分布统计。

1.4 sRNA分类注释统计

对所有small RNA与各类RNA进行比对以实现对其进行分类注释。考虑到存在一个sRNA可能同时比对上几种不同的注释信息的情况，为了使每个unique sRNA有惟一的注释，按照已知miRNA>rRNA>tRNA>snRNA>snoRNA>repeat>gene>novel miRNA的优先级顺序将small RNA进行比对注释。

2 结果与分析

2.1 测序数据质量

对不同位置的测序错误率分布进行检测。结果（图1）表明，除前4位碱基的错误率接近0.5%外，其他位置的碱基错误率均低于0.5%，表明测序质量较高。

2.2 长度分布

哺乳动物miRNA的长度区间一般位于18～30个核苷酸间。对本研究中3个小RNA文库的纯净序列进行核苷酸长度统计，分析了样品中的miRNA长度分布，结果如图2所示。miRNA序列长度主要分布在20～24 nt范围内，占纯净序列的90%以上。其中，长度为22 nt的miRNA分布最多，占到了纯净序列的60%左右，其次为23 nt，再次为21 nt。

2.3 首位碱基偏向性

由图3可知，首位碱基的分布在不同长度miRNA中有很强的偏向性。肌肉中18～24 nt的小RNA首位碱基以U为主，其次为碱基A，而G与C在miRNA中所占的比例相对最小。其中长度为20、22、23、24位的首位碱基为 U的小RNA所占比例较高，均在90%以上。

2.4 miRNA的分类注释

测序样品的质量可以通过其他RNA类型所占比列进行评价。测序结果中其他类型RNA的比例仅占2.07%（表1）。重复序列在被剔除的RNA类型中占的比重最大，达到被剔除总量的43.48%。而来自外显子的序列比例占0.51%，表明mRNA的降解程度低，构建的miRNA文库质量高，测序样本可信度高。miRNA经注释后，67%的序列被注释为已知miRNA，不难看出测序所获得的序列主要是miRNA。

3 讨论

高通量测序技术具有覆盖度深和性价比高的特点，能避免生物信息学方法在miRNA发掘上过度依赖物种全基因组信息和cDNA克隆受高表达RNA干扰的问题，对鉴定和发掘不同发育阶段和生理状态下生物体的miRNA起到了极大的推动作用[11]。目前利用该技术已经对灵长类哺乳动物的miRNA进行了成功的发掘[12，13]。本研究构建了3个新西兰公兔的miRNA文库，利用Illumina公司的Solexa技术进行序列测定，产生了10 512 981条纯净序列。对Illumina高通量测序平台而言，测序错误率会随着测序序列长度的增加而升高，同时，建库过程中反转录需要随机引物导致前几个碱基的测序错误率也会增加[14，15]。但从其他位点的错误率和其他RNA类型所占比列来看，高通量测序同样适合肉兔肌肉组织中的miRNA的系统发掘。

张晓东等[16]利用Solexa平台对山羊卵巢组织中的miRNA进行了系统的发掘和鉴定，对长度分析后发现，miRNA长度主要分布在22 nt，占到了50%以上，其次是长度为23 nt的miRNA，达到了20%。熊显荣等[17]利用高通量测序技术对牦牛卵巢的小RNA进行了测序，长度为22 nt的miRNA序列居多，达到了50%，其次是长度为23 nt的miRNA，达到了20%。凌英会等[18]利用Solexa平台对绵羊肌肉组织中的miRNA进行了测序和分析，发现肌肉中小RNA的长度一半左右为22 nt，20%左右为23 nt。本研究中长度为22 nt的小RNA占到了1/2，23 nt的小RNA达到17%以上。不同畜种和不同组织器官间小RNA的分布差异不大，表明这些miRNA在作用机制上基本一致。但植物上的研究结果与动物的结果却存在较大的差异。黄儒等[19]采用HiSeq深度测序技术对低温胁迫下的东农冬小麦进行小RNA鉴定，分析后发现长度为24 nt的小RNA为主要类型，占总量的40%以上，其次是长度为21 nt的小RNA，達到了20%左右，可能植物和动物的小RNA在作用方式上存在较大的差异。另外，21 nt可能是mRNA 表达所需的最小热力学稳定长度的要求。与经典的转录翻译途径相比，将70 nt 左右的前体剪切为21 nt左右的成熟miRNA要简单快速得多，可以实现对基因表达的快速调控，加强生物体对环境刺激的反应[20]。叶茂等[21]认为大约21 nt的排列组合产生的miRNA，可以满足其所要调控的基因数量，而不会造成浪费，并且转录的长度越短，转录出错率也就越小，这对调控过程可能更为有效。

首位碱基偏向性研究均发现不同组织中鉴定的miRNA均具有U和A碱基偏向性。张方等[22]利用Solexa测序技术对肾周（PEF）、皮下（SUF）和尾部（TAF）脂肪进行了测序，发现PEF和SUF文库中首位碱基偏向U，所占比例均为95%左右，其次为碱基A、G和C含量。胡俊杰等[23]利用高通量技术对甘肃高山细毛羊性成熟期卵巢的miRNA进行了鉴定，结果表明，卵巢上的19、20、22、24 nt的小RNA首位碱基以U为主，21、25和26 nt的小RNA首位碱基以A为主，同时卵巢上的RNA长度主要分布在22和21 nt上。首位碱基的偏向性不仅与miRNA的成熟过程有关，可能还与靶基因的结合，以及对靶基因的表达调控有关。核苷酸序列的物理或生物学特性会受其碱基组成的影响。首位碱基为U使得miRNA更容易被AGO蛋白识别。分析miRNA首位碱基有助于评价测序质量和了解miRNA的生物学功能。

4 结论

本研究利用Solexa测序技术对3只84日龄新西兰公兔的腿肌进行了miRNA测序，获得了质量好、可信度高的序列，该技术适合家兔肌肉中miRNA的发掘。miRNA长度以22 nt为主，首位碱基以U为主，其次为碱基A，可以对长度分布的不平衡性和首位碱基的偏向性与miRNA的作用机理展开进一步的研究。

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