肿瘤转移前微环境形成机制的研究进展

邹 伟, 张婷婷，曹玉珠，李晓曼，吴媛媛，陈文星,2，陆 茵,2，王爱云,2

(南京中医药大学1. 药学院，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，2. 江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京 210023)

肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因，转移性肿瘤细胞广泛分布以及强侵略性，降低了癌症治疗的有效性。因此，肿瘤转移仍是当今科学研究的重心。转移的肿瘤细胞成功浸润远端器官并成瘤，伴随一系列复杂分子生物学的改变。而进入循环系统的肿瘤细胞最终形成转移灶，是一个艰难且低效的过程，它不仅取决于肿瘤细胞脱离原发灶转移到远端器官的能力，还受到靶器官微环境的影响。研究表明[1]，肿瘤在尚未发生转移之前，首先诱导远处待转移器官中微环境发生适应性的改变，以营造一个适宜转移的肿瘤细胞在此处定植、生长，并形成继发转移灶的环境，这个支持性微环境称为“转移前微环境”(pre-metastatic niches，PMNs)。本文就目前对原发性肿瘤驱动特异性器官中PMNs形成的主要过程及机制进行再探讨，并探索可能的临床意义，以期通过逆转PMNs的形成来治疗转移性肿瘤。

1 PMNs的亲器官性

PMNs的提出意味着肿瘤转移并不是一个简单随机的过程，而是具有目的性的。特定的肿瘤细胞总是倾向于转移到特定的组织器官，表现为肿瘤转移的亲器官性[1]。不同类型的肿瘤细胞可以分泌特定的细胞因子，通过靶向性干预PMNs，使PMNs发生分子和细胞水平的器质性改变，从而为肿瘤细胞的定植提供适宜的环境，促进肿瘤靶向性转移。

肺、肝、骨、脑是最常见的肿瘤转移靶器官。研究发现，皮肤黑色素瘤高表达迟现抗原4(very late activation antigen 4，VLA-4)，通过与肺血管内皮细胞上过量表达的血管细胞黏附分子1特异性结合，使肿瘤细胞优先选择肺作为转移的部位[2]。肠癌细胞通过分泌血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)等细胞因子，引起肝星状细胞的活化，继而肝星状细胞通过分泌趋化因子受体2(C-C chemokine receptor type 2，CCR2)，与肿瘤细胞分泌的趋化因子配体2(chemokine C-C motif ligand 2，CCL2)结合，促进选择性肝转移[3]。乳腺癌以溶骨性病症为主，成骨细胞分泌的趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12)结合乳腺癌细胞表面趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)，从而诱导乳腺癌细胞定向转移[4]。黑色素瘤脑转移中，星形胶质细胞可在肿瘤细胞刺激下产生白介素23(interleukin 23，IL-23)，从而刺激肿瘤细胞中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)水平上调，有利于PMNs的形成，进而促进肿瘤细胞增殖[5]。

2 PMNs形成的机制

肿瘤衍生的分泌因子(tumor-derived secreted factors，TDSFs)、肿瘤细胞外泌体(extracellular vesicles，EVs)和骨髓来源细胞(bone marrow-derived cells，BMDCs)是PMNs形成的3个关键因素。具体而言，原发性肿瘤的TDSFs、EVs诱导BMDCs到达待转移靶器官，事先营造一个利于肿瘤转移的炎性微环境，继而有利于肿瘤细胞在PMNs的定植、存活和增殖。

2.1PMNs与TDSFsTDSFs在肿瘤PMNs形成中起关键作用。肿瘤细胞到达靶器官之前，会释放出若干因子，某些因子会直接作用于靶器官，使微环境发生改变，以适宜转移瘤细胞存活和增殖；而某些因子在到达靶器官后，会诱导靶器官的间质细胞释放一些细胞因子，以引导肿瘤细胞定植。研究发现[6]，原发肿瘤细胞肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)能够特异性地诱导肺部炎性蛋白S100A8和S100A9的高表达，紧接着Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)信号通路被异常激活，产生炎性应答，在肺部形成炎性微环境，从而利于肿瘤细胞的转移与定植。中枢神经系统中，肿瘤细胞通过分泌巨噬细胞迁移抑制因子、IL-8以及纤溶酶原激活物抑制因子1，激活星形胶质细胞，分泌IL-6、TNF-α，从而参与肿瘤血管的构建，引导肿瘤细胞转移到靶器官[7]。此外，在PMNs形成过程中，发挥重要作用的另一肿瘤衍生因子是CCL2。CCL2是趋化因子CC亚家族重要的一员，在许多原发性肿瘤中，CCL2过表达与患者预后差存在相关性。研究显示[8]，转移性结肠癌细胞释放的趋化因子CCL2与血管壁内皮细胞相结合，并激活相应的受体CCR2，增强血管内皮细胞的渗透性，促进肿瘤细胞转移。神经胶质细胞分泌的外泌体携带的miRNA通过下调肿瘤细胞内抑癌基因PTEN的表达，促进肿瘤细胞分泌CCL2，进一步募集髓细胞至脑部，形成利于肿瘤细胞转移至脑部的微环境[9]。乳腺癌细胞分泌的CCL2，一方面通过增强破骨细胞分化功能，有效促进骨转移，另一方面通过促进巨噬细胞的浸润，调节肺部早期PMNs的形成[10]。

2.2PMNs与肿瘤细胞EVsEVs是由多种类型活细胞分泌的纳米级囊泡小体，含多种生物活性物质，这些生物活性物质可在细胞间穿梭，并介导细胞间的物质转运与信息交流，进而影响细胞的生理功能。EVs被证明可以决定肿瘤转移的器官趋向性，并且参与肿瘤PMNs的形成。研究发现，Lewis肺癌细胞分泌的EVs中的RNA，通过NF-κB和MAPK途径，激活肺泡Ⅱ型上皮细胞TLR3，募集中性粒细胞在肺组织中形成PMNs，促进肿瘤细胞在肺部的定植和转移[11]。胰腺癌细胞来源的EVs通过诱导肝脏Kupffer细胞释放TGF-β，产生肝星状细胞的纤连蛋白，促进肝脏募集巨噬细胞以及中性粒细胞，为肝转移提供了有利的PMNs[12]。另有研究表明，胰腺癌细胞EVs携带的miR-494、miR-542-3p能够抑制淋巴结中基质细胞钙黏蛋白的连接，上调基质金属蛋白酶类的表达，从而建立淋巴结转移所需要的微环境，促进肿瘤细胞淋巴结转移[13]。

2.3PMNs与BMDCs在多种TDSFs的作用下，BMDCs动员入血，并作用于远端靶器官，于肿瘤细胞达到之前，在靶器官局部形成适宜肿瘤生长的PMNs。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)通过改变荷瘤机体靶器官的宿主炎性反应或是免疫微环境，如降低自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的细胞活性、促进肿瘤细胞上皮间质转化等，促进PMNs的形成，以利于游离肿瘤细胞在靶器官黏附、生存和增殖。MDSCs作为构成BMDCs的重要亚群，在PMNs构建中发挥了不可替代的作用。研究表明[14]，在小鼠Lewis肺癌模型中，表达VEGFR1的BMDCs归巢到特异的转移前位点，同时高表达整联蛋白a4β1，特异性地与靶器官纤维连接蛋白表位结合，不但在靶器官中高度聚集，为弥散的肿瘤细胞提供了强有力的“停泊位点” ，而且能够特异性诱导肺实质内炎性蛋白S100A8/A9和铃蟾多样性肽8的表达，进一步诱导MDSCs迁移，共同构建PMNs。此外，肿瘤细胞中神经鞘氨醇-1-磷酸化受体-1(sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1)-信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)表达上调可产生一系列生物活性因子，进一步激活转移前器官中多种细胞的S1PR1-STAT3信号通路，促进PMNs中MDSCs持续扩增，从而利于PMNs的形成[15]。

3 PMNs的演变过程

PMNs的形成并不是一蹴而就的，血管渗漏及通透性增强，基质细胞的激活，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的重塑，免疫细胞的募集，促进PMNs的发生与发展。

3.1血管渗漏及通透性增强血管发生渗漏、通透性增强是PMNs形成初始阶段的重要标志。由于肿瘤组织内微血管基质不完善，如血管壁缺乏平滑肌支持、血管壁薄、易通透，使得肿瘤细胞衍生的因子以及蛋白酶类易渗漏至血管内皮细胞间隙，促使肿瘤细胞内渗，增强其转移能力。

研究表明，肿瘤分泌因子如VEGFA和血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4)，通过激活黏着斑激酶，破坏内皮细胞接触，增强肺微血管的通透性，促进肿瘤转移[16]。此外，乳腺癌细胞表达的表皮生长因子受体、表皮调节素、环氧合酶2、MMP-1和MMP-2相互协同，增加血管通透性，使循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)外渗，以促进肺转移[17]。MMP家族中的另一个成员MMP-9也密切参与调节PMNs中的血管完整性，近来一些研究表明，肿瘤细胞到达靶器官之前，CD11b+/Gr-1+髓系细胞可通过分泌MMP-9等因子，减少周细胞覆盖，破坏血管内皮的VE-钙黏蛋白连接，造成血管的高渗透性[18]。由于肿瘤细胞移出血管，并和髓系细胞以及活化的血小板聚集成团，从而为PMNs的形成和肿瘤细胞的靶向性转移提供了有利条件。

3.2基质细胞激活血管内皮细胞结构功能的异常只是PMNs进化过程中的一个改变，其他基质细胞，如肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)等也会被激活，从而有利于PMNs的建立。

肿瘤细胞以及肿瘤相关间质细胞释放CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL12、CXCL8等趋化因子，以及VEGF、内皮素2、PDGF等细胞因子，可促进TAMs的募集[19]。这些刺激因子相互协作，诱导TAMs到达肿瘤周围的基质区域，随后TAMs穿透基底膜，到达周围正常的组织基质，提高肿瘤细胞的侵袭性，进一步加剧PMNs的形成。另外，肿瘤细胞通过分泌TGF-β 和PDGF等细胞因子，激活组织内正常的成纤维细胞，使之成为CAFs，继而原位肿瘤细胞、CAFs分泌的细胞因子，以及同ECM重塑相关的蛋白，共同构建以炎症细胞为主要成分的PMNs[20]。另外，肿瘤来源的EVs能够诱导基质细胞中特定的S100蛋白家族表达上调，如乳腺癌细胞来源的EVs能够上调肺成纤维细胞中S100A4、S100A6、S100A10、S100A11、S100A13、S100A16的表达，而胰腺癌细胞来源的EVs能够上调Kuffer细胞中S100P和S100A8的表达，通过促炎症微环境来调节PMNs的形成。

3.3ECM重塑在形成PMNs的复杂过程中，ECM发生着明显变化，而这种变化可通过两种机制实现，即ECM蛋白的表达水平与相对组成的改变，以及ECM空间拓扑结构与刚性等物理学性质的改变。

Fig 1 Mechanism of pre-metastatic niche formation

近年来，肿瘤微环境中ECM纤维生成备受关注。TGF-β能通过JNK、p38、ERK、Akt等信号通路，激活细胞核内的转录因子，促进ECM纤维的生成，从而利于PMNs构建，介导肿瘤转移[20]。此外，非细胞因素如组织缺氧，也与PMNs的形成息息相关。人源性肿瘤细胞缺氧时，可分泌赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)，其与胶原蛋白和弹性蛋白交叉连接有关。研究表明[21]，LOX与LOXL2 的高表达，促进了肿瘤中胶原蛋白的沉积，增强了ECM的硬度，并促进乳腺癌与肺癌的侵袭与转移；而抑制LOX/LOXL2的氧化酶活力，减缓了组织的纤维化与肿瘤的发生。不仅如此，LOX家族也是TGF-β所依赖的蛋白质，骨膜素生成可通过增强Wnt信号传导，从而维持起始转移细胞的浸润。

3.4免疫细胞的募集免疫细胞参与了从肿瘤细胞开始启动侵袭，到PMNs形成的各个环节。原发肿瘤细胞还“劫持”不同类型的免疫细胞，导致其在PMNs中的异常分化和累积。淋巴细胞、MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞，这些免疫细胞的功能失调和破坏，帮助肿瘤细胞免疫逃逸。MDSCs抑制γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)介导免疫应答，同时诱导促炎细胞因子，如白介素和基质细胞衍生因子1(SDF1)的表达，通过募集BMDCs，产生促炎症免疫抑制性PMNs[22]。此外，中性粒细胞在PMNs中的作用也不容小觑。研究显示，中性粒细胞可在肿瘤细胞分泌的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、外泌体及基质细胞来源的SDF1的介导下，在转移性器官中扩增[23]。中性粒细胞产生的白三烯可通过选择性富集肿瘤干细胞，促使肿瘤远处转移。而通过特定技术手段抑制肿瘤PMNs中的中性粒细胞聚集，可以阻止肿瘤转移的发生(Fig 1)。

4 PMNs的检测

目前，针对恶性肿瘤患者，通常使用放射学成像技术，如电子计算机断层扫描(computed tomography，CT)、正电子发射型计算机断层显像(positron emission computed tomography，PET)来评估转移灶的形成。但检测小于1 cm的肿瘤，PET和CT成像结果是不可靠的，并且也不能区分良性炎症和恶性病变。因此，提高肿瘤转移检测的可靠性显得尤为必要。目前，正开发更高分辨率的成像技术，并积极寻求早期转移的遗传生化标志物。

研究表明[24]，CD68+骨髓细胞中S1PR1-STAT3信号传导的激活对于PMNs的形成至关重要，其中CD68+骨髓细胞可作为检测PMNs形成的潜在分子。此外，在转移前的早期阶段，乳腺癌患者血清中能够检测到肿瘤细胞来源EVs中的miR-105[25]，因此，开发相关技术，以提高来自癌症患者血液中肿瘤来源的EVs等相关生物标志物检测的灵敏性迫在眉睫。

5 小结

肿瘤转移不仅依赖于肿瘤细胞自身的侵袭能力，还与肿瘤PMNs的形成密切相关。自1889年Paget等[26]提出“种子与土壤”(seed and soil)假说以来，有关PMNs形成的复杂分子机制研究不断取得进展，这些进展为更好地阐明肿瘤转移的机制，以及设计更有效的癌症诊断和治疗策略提供了依据。PMNs是肿瘤动员骨髓源性细胞和宿主基质细胞等相互作用而产生的，很大程度上决定了循环肿瘤细胞能否在待转移灶部位附着、生存、增殖，并最终促进肿瘤转移。近年来，与PMNs相关的细胞EVs的研究日益增多，EVs因其流通性、丰富性和稳定性，有望成为评估PMNs形成的生物标志物。而有目的性地控制肿瘤EVs产生，可能是破坏PMNs形成，控制肿瘤转移的有效方法之一。已有研究表明，用超顺磁性氧化铁纳米颗粒或碘同位素标记EVs，能够进行敏感的磁共振或射线照相追踪。PMNs是一个极其复杂的微环境，因此至今仍有很多关键问题未得到解答。PMNs还有哪些重要组成？PMNs能否作为癌症转移的生物标志物？PMNs形成的进程能否被阻碍？进一步加强PMNs形成机制的探讨，将有助于新靶点的发现。