大豆GmWRKY148的克隆与功能分析

王莎莎，崔晓霞，黄颜众，轩慧冬，郭娜，邢邯



大豆的克隆与功能分析

王莎莎，崔晓霞，黄颜众，轩慧冬，郭娜，邢邯

（南京农业大学农学院/国家大豆改良中心/农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室/作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095）

【目的】WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关。通过对大豆WRKY转录因子基因的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析，探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理。【方法】以拟南芥的序列为探针，利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因，命名为。对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析；利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平；利用双酶切的方法将完整的CDS序列连接到植物过表达载体pBinGFP2中，利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中，进行亚细胞定位分析。利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系，经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测，获得大豆过表达的阳性发状根（OE-）和转入pBinGFP2空载体（EV）的阴性对照发状根。对过表达发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌，统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况。【结果】的CDS序列全长为999 bp，编码332个氨基酸，等电点为7.61。系统进化分析发现，GmWRKY148与菜豆()、蒺藜苜蓿（）的WRKY转录因子亲缘关系十分相近，且与菜豆的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，GmWRKY148定位在细胞核中。组织表达分析显示，在根中的表达量最高，在茎和叶中次之，在子叶中最低。荧光定量PCR结果表明，接种大豆疫霉菌P6497后，在感病品种Williams和抗病品种Williams 82（含有）中，受诱导逐渐上调表达，在侵染24 h后表达水平均达到最高，但在Williams 82中的上调倍数更高。对过表达和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块，比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量，结果显示，与对照EV相比，过表达大豆阳性发状根的病斑长度显著变短，疫霉积累量显著降低。对过表达和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子，并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量，统计结果显示，过表达的大豆阳性发状根与对照EV相比，菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。【结论】参与调控大豆与大豆疫霉的互作，能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。

大豆；；大豆疫霉根腐病；抗性

0 引言

【研究意义】大豆疫霉菌（）引起的大豆疫霉根腐病（，PRR）是一种毁灭性的土传病害，在全球范围内均有发生，造成巨大的产量和经济损失[1]。WRKY转录因子在植物生长发育和逆境胁迫方面有着十分重要的作用[2]。因此，研究在大豆疫霉根腐病抗性方面的功能，对于大豆抗病分子育种有重大意义。【前人研究进展】WRKY蛋白能够与抗病相关基因启动子的W-box结合，激活下游抗病基因的表达，从而开启植物的抗病防卫系统[3-6]。WRKY转录因子的下游靶标基因和上游调节基因之间的相互作用构成了复杂的WRKY转录因子调控网络[7]。Han等[8]研究发现，在拟南芥中，AtWRKY44蛋白可以与TOE1（的一个靶标蛋白）进行互作，--可能通过糖信号通路来调节拟南芥的干旱胁迫。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号级联存在于所有真核生物中，并在ABA参与的防御反应的下游信号传导中起作用[9-10]。Li等[11]研究发现拟南芥和是MAPK介导的对病原体抗性通路的重要组成部分。的同源基因在拟南芥叶片中的瞬时表达，可以增强其对细菌和真菌病原体的抗性。Danquah等[12]研究表明水稻通过MAPK磷酸化级联反应能够增强水稻的抗旱性。WRKY转录因子也参与植物激素信号转导。Jiang等[13]研究表明SA可诱导杨树过表达，从而加速PR蛋白的表达，提高对杨树黑斑病的抗性。Zhang等[14]发现在冷应激处理后，过表达黄瓜的转基因拟南芥在冷胁迫处理时具有较高的幼苗存活率，且种子萌发期间对ABA具有较高的敏感性。各种非生物胁迫，包括热胁迫、氧化应激、干旱和营养缺乏会对植物的生理和生化过程产生不利影响[15-16]。在拟南芥中，过表达棉花可上调与衰老相关的基因、和的表达，有助于转基因拟南芥植株延迟叶子的衰老[17]。Wu等[18]通过对过表达水稻的转基因株系进行热处理，转基因株系表现出显著的高温耐受性，如叶子萎蔫的更慢、受损部位更小。He等[19]研究发现小麦转基因株系的耐热性与野生型相比明显增强。Jia等[20]发现过表达棉花植株在干旱和盐胁迫条件下，对氧化应激的耐受性降低，这与活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累、酶活性的降低、MDA含量的升高以及ROS相关基因表达的改变相关。在抵御生物胁迫方面，WRKY转录因子的大多数功能已经明确，但调控机理的研究还不够充分。在大麦（）中白粉病病原菌（）的无毒基因所编码的效应因子能够激活大麦的CC-NBS-LRR类抗病蛋白HvMLA10。HvMLA10与HvWRKY1互作，解除HvWRKY1对HvMYB6的抑制，从而启动防卫反应[21]。拟南芥转录因子又称为RRS1，除WRKY结构域外，还包含TIR（toll and interleukin-1 receptor）、NBS和LRR结构域，介导拟南芥对病原菌青枯病菌（）的抗病性[22]。Cheng等[23]研究证明是水稻抗稻瘟病正调控因子。Wang等[24]研究证明在小麦高温苗木（HTSP）抗条锈菌（）的过程中可能激活了SA和ET信号通路。【本研究切入点】关于大豆WRKY基因家族己有一些报道，但WRKY基因对大豆疫霉根腐病抗性的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究拟从大豆中克隆出的CDS全长序列，对其进行组织表达分析和大豆疫霉菌诱导表达分析，利用发根农杆菌介导的遗传转化体系获得大豆发状根，对过表达的大豆阳性发状根的抗病性进行鉴定，为进一步探究大豆与大豆疫霉菌互作过程的作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2017年3月至2018年3月在南京农业大学农学院完成。

1.1 试验材料

大豆栽培品种Williams和Williams 82由南京农业大学国家大豆改良中心提供。大豆疫霉菌P6497和P6497R（携带有RFP），由南京农业大学植物保护学院王源超教授提供。植物表达载体pBinGFP2由植物保护学院窦道龙教授提供。发根农杆菌菌株K599由南京农业大学农学院邢邯教授实验室保存。

1.2 诱导处理

采用根部接种的方法进行疫霉菌诱导处理。将大豆Williams和Williams 82的种子播种于恒温25℃、16 h/8 h光周期的光照培养箱中。待其生长至两片真叶完全展开时，在根茎交界处划一个约1 cm的伤口。用培养4—5 d的大豆疫霉菌P6497对伤口进行接种。分别在接种后0、6、12和24 h取伤口上下2 cm长的根部组织，液氮速冻并于-80℃保存。

1.3 实时荧光定量PCR分析

利用植物总RNA提取试剂盒（DP419，TIANGEN）提取大豆各组织的总RNA，并反转录获得cDNA。根据基因序列设计qPCR引物，作为内参基因。使用SYBR Green Master Mix（Q111-02，Vazyme）试剂进行实时荧光定量PCR，利用2-ΔΔCT方法计算相对表达量，并用GraphPad prism 5软件作图。

1.4 基因克隆及过表达载体构建

提取大豆Williams 82根部组织的RNA，反转录得到cDNA。以此为模板进行PCR扩增，获得目的基因，与pEASY-Blunt载体连接、鉴定，用于构建pBinGFP2过表达载体。

1.5 亚细胞定位

提取质粒，浓缩使其浓度≥1 000 ng·μL-1。洋葱内表皮摆放于MS培养基上，暗培养4 h。通过基因枪技术将包裹了重组质粒的球状金粉转入洋葱表皮细胞，之后暗培养16—20 h，用激光共聚焦显微镜进行观察。

1.6 大豆发状根的获得

1.6.1 电击转化农杆菌K599感受态细胞 100 μl K599感受态加1.5 μl质粒装入冰浴的电击杯中，电击转化。加入1 ml YEP培养基，菌液扩培4—6 h。4 500 r/min，2 min离心，弃上清，吸取50 μl涂在YEP加抗生素（YEP+RIF+Kan）的固体培养基上，2 d后挑单克隆，并进行PCR验证。

1.6.2 发根农杆菌介导的遗传转化 将20 μl-加入4 ml（YEP+RIF+Kan）液体培养基中，28℃振荡培养，12—16 h后涂板。挑选颗粒饱满无破损的大豆Willams用氯气消毒。把灭菌的大豆种脐向下种于GM固体培养基中（一皿25—35个），过夜，使大豆充分吸胀。

将农杆菌加入CCM液体培养基中，充分混匀，测OD值（0.6—1.0）。将吸胀的大豆（沿培根对半剖开）浸入菌液中，90 r/min振荡30 min。然后暗培养4—5 d，放入white培养基中继续生长，获得大豆发状根。

1.7 大豆转基因发状根抗性的鉴定

将培养约3周龄的大豆转基因发状根在荧光体视显微镜下进行荧光筛选，对有绿色荧光的大豆转基因发状根进行标记，并扩培。大豆疫霉2号生理小种P6497，在V8固体培养基上培养4 d后进行接种（电子附图1)。切取约3 mm×3 mm的大豆疫霉菌丝块，接种于阳性大豆根毛伸长区，侵染24 h后，利用游标卡尺测量病斑长度。

游动孢子接种（电子附图2）：选择新鲜的大豆疫霉菌P6497，于25℃黑暗条件下过夜（约10 h）培养，诱导产生游动孢子。带有荧光的大豆转基因发状根放入10 ml离心管中，加入游动孢子过滤液，25℃黑暗培养，接种后24、36和48 h取样。

大豆转基因发状根的侵染及侵染水平分析：将经过GFP荧光筛选后得到的阳性大豆转基因发状根（电子附图3）接种大豆疫霉菌P6497，于24、36和48 h后取样，利用荧光体视显微镜（OLYMPUS MVX10，JAPAN）观察游动孢子对阳性大豆发状根的侵染以及卵孢子的萌发情况，并计数。利用qRT-PCR方法检测疫霉的相对积累量（引物序列见电子附表1），以疫霉内参基因与大豆内参基因相对表达量的比值来衡量。

1.8 GmWRKY148蛋白进化树分析

用GmWRKY148的氨基酸序列在NCBI进行BLAST比对，下载同源性高的蛋白质序列，保存为fasta格式。先用Clustal X软件进行多重序列比对，再利用MEGA 7.0软件进行进化树作图。

2 结果

2.1 GmWRKY148蛋白进化树分析

利用MEGA 7.0软件对GmWRKY148与其他植物的WRKY氨基酸序列构建系统进化树（图1）。结果表明，GmWRKY148蛋白属于大豆WRKY转录因子家族基因，与苜蓿（）、菜豆（）等植物亲缘关系十分相近。

：大豆Glycine max；：苜蓿Medicago truncatula；：菜豆Phaseolus vulgaris；：木豆Cajanus cajan；：鹰嘴豆Cicer arietinum；：羽扇豆Lupinus angustifolius；：GmWRKY148；：花生Arachis ipaensis；：赤豆Vigna angularis

2.2 GmWRKY148的表达分析

2.2.1的组织表达分析 从Williams 82的根中克隆得到，利用荧光定量PCR方法，分析大豆在根、茎、叶和子叶中的表达量（图2）。结果表明，在大豆的根中的表达量最高，在茎和叶中次之，在子叶中的表达量最低。

2.2.2的诱导表达分析 利用荧光定量PCR分析大豆Williams和Williams 82（含有）根部接种疫霉菌后的转录水平。在感病品种Williams中，的表达量在接种后12 h开始上调，在24 h达到最大值，大约是接种前的10倍（图3-A）。在抗病品种Williams 82中，的表达在接种后6 h显著上调，12 h下调表达，之后在接种后24 h再次上调，达到最大值（图3-B）。从图中可以看出，在抗病品种Williams 82中的相对表达量显著高于感病品种Williams，推测可能参与大豆对疫霉菌的响应。

2.3 GmWRKY148蛋白的亚细胞定位

利用基因枪法将-重组质粒转化到洋葱表皮细胞中，暗培养16—20 h，用激光共聚焦荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的分布。结果显示，在转化空载体的洋葱表皮细胞中，细胞膜、细胞质以及细胞核中均有绿色荧光分布，而在转化重组质粒的洋葱表皮细胞中，绿色荧光主要分布于细胞核部位（图4）。表明GmWRKY148是一个核定位蛋白。

**表示在P < 0.01水平差异极显著。下同

A：疫霉诱导下大豆栽培品种Williams中GmWRKY148的表达模式。B：疫霉诱导下大豆栽培品种Williams 82中GmWRKY148的表达模式

2.4 OE-GmWRKY148大豆发状根的获得

为了探究在大豆对大豆疫霉菌抗性中的功能，将在大豆发状根中进行过表达分析，并利用荧光体视显微镜进行初步筛选（图5），将阳性大豆发状根在White培养基上扩大培养。为了进一步检测的上调表达倍数，将分别扩培的过表达（OE-）和转pBinGFP2空载体（EV）的大豆发状根提取RNA，检测的表达情况（图6），与空载体对照相比，其上调表达倍数达到4—6倍，可用于后续的功能研究。

a、b、c、d：35S-GFP定位；e、f、g、h：35S-WRKY148::GFP融合蛋白定位

a：GFP转化大豆Williams的发状根。b：过表达GmWRKY148的大豆Williams发状根

2.5 GmWRKY148可提高大豆对大豆疫霉菌的抗性

在大豆Williams中过表达，获得OE-大豆发状根。同时将空载体pBinGFP2转入大豆Williams作为对照。通过GFP荧光筛选得到阳性大豆发状根，在阳性大豆发状根上接种新鲜的大豆疫霉P6497菌丝块，24 h后观察接种部位病斑扩展情况。病斑长度统计结果显示，过表达的大豆转基因发状根（W-OE-W148）接种大豆疫霉菌P6497后的病斑长度明显比Williams空载体对照（W-EV）短（图7-A、图7-B、图7-C）。

图6 Williams阳性发状根的上调表达倍数检测

将过表达的大豆Williams阳性发状根与对照在white培养基上扩大培养，选取根尖长势一致的大豆转基因发状根接种大豆疫霉游动孢子，结果显示，过表达的大豆发状根中的疫霉累积量明显低于空载体对照（图7-D）。综上所述，过表达使Williams对大豆疫霉菌P6497的抗性增强。

2.6 OE-GmWRKY148的大豆发状根和对照中菌丝的侵染及卵孢子的萌发情况

利用荧光体视显微镜观察大豆转基因发状根中菌丝的侵染及卵孢子的萌发情况（图8）。接种后24 h，对照EV大豆转基因发状根有35%被侵染，15%产生了卵孢子；而OE-的大豆发状根只有15%被侵染，且没有萌发的卵孢子。接种后36 h，对照EV大豆发状根，有65%被侵染，30%的大豆转基因发状根能观察到萌发的卵孢子；而对于OE-的大豆发状根，仅有25%被侵染，10%的阳性大豆发状根能够观察到萌发的卵孢子。接种后48 h，对照EV大豆发状根80% 被侵染，60%能观察到萌发的卵孢子；而OE-的大豆发状根仅有45%被侵染，20%的阳性大豆发状根能够观察到萌发的卵孢子（电子附表2）。接种大豆疫霉菌P6497的游动孢子24、 36和48 h后，OE-的大豆Williams发状根与对照EV相比，侵染率以及卵孢子萌发率都较低。综上所述，过表达能够显著提高大豆对大豆疫霉菌的抗性。

A：转pBinGFP2空载体的Williams病斑表型。B：过表达GmWRKY148的Williams病斑表型。C：疫霉菌P6497侵染大豆发状根24 h后，大豆Williams中空载对照和OE-GmWRKY148发状根病斑长度统计。D：P6497游动孢子接种后24和36 h，过表达GmWRKY148的大豆Williams发状根和对照中疫霉相对生物积累量的分析

图8 大豆Williams发状根中疫霉侵染的显微观察

3 讨论

大豆疫霉菌（Kaufmann & Gerdemann）可在条件适宜时侵染大豆，有多个生理小种，难以防治[25]。YANG等[26]研究表明采用多种防治措施相结合的综合防治技术是根本有效的防治途径，其中应用抗病品种防治大豆疫霉根腐病最为有效。本研究使用大豆疫霉菌P6497以及感病品种Williams和携带-的抗病品种Williams 82作为试验材料。陶恺[27]研究发现大豆疫霉菌侵入后扩展阶段，绝大多数休止孢在接种后6 h已经成功入侵寄主。在抗病品种Williams 82和感病品种Williams中的表达情况存在差异（图3），接种后6 h在Williams 82 中该基因上调表达倍数更高，说明受到大豆疫霉菌P6497的诱导，很有可能与大豆抵御大豆疫霉的侵染过程有关。为了进一步研究在大豆抗疫霉菌侵染中的功能，将其在大豆Williams进行过表达。Moy等[28]研究表明大豆疫霉菌在侵染初期以菌丝体形式扩展定殖，在12－24 h形成病斑，因此选择在侵染后24 h测量病斑长度。转OE-的大豆Williams发状根与对照EV的大豆Williams发状根相比病斑长度明显变短（图7-A、图7-B、图7-C）。

大豆疫霉是典型的土传卵菌，卵孢子能够在土壤中存活数年，成为次年病害发生的初侵染源[29-30]。Sinclair[31]发现卵孢子萌发后，产生孢子囊继而释放出游动孢子是病害能够发生的必要条件。Hardham等[32-33]研究证明游动孢子感知寄主信号，聚集形成休止孢，同时分泌粘性物质让休止孢粘在寄主根的表面，进而萌发芽管，芽管直接通过细胞间隙和根的垂周壁直接侵入寄主或形成附着孢侵入寄主。张鑫[34]研究发现大部分致病疫霉等的孢子囊可以脱落并直接作为侵染源，而另外一些则不能脱落，以游动孢子为侵染源，如大豆疫霉。综上所述，卵孢子的萌发情况与游动孢子的数量是大豆疫霉根腐病发生的重要指标。

为了研究在大豆疫霉根腐病中的功能将OE-的阳性大豆发状根浸入大豆疫霉游动孢子液中，24、36和48 h取样进行观察。大豆疫霉游动孢子接种大豆发状根后，转OE-的大豆Williams发状根与对照EV相比，疫霉的积累量在接种后24和36 h，都显著低于对照EV（图7-D）。游动孢子侵染发状根24、36和48 h后，转OE-的大豆Williams发状根与对照相比，侵染率以及卵孢子萌发率都较低（图8、电子附表2）。以上结果表明，转OE-的大豆发状根对大豆疫霉的抗性明显增强，过表达能够提高Williams对大豆疫霉菌的抗性。但是的调控机制还有待于更进一步研究。

4 结论

克隆获得，其CDS为999 bp。在Williams和Williams 82中受疫霉诱导产生表达差异，过表达可以提高大豆品种Williams对大豆疫霉菌P6497的抗性。

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（责任编辑 李莉）

附表1 试验所用引物序列

Table S1 Primers used in this study

基因Gene引物序列Sequence of primer (5'-3')引物用途Function of primer GmWRKY148F：GCAGCTTCTAACTCTGGCGAGmWRKY148克隆Cloning of GmWRKY148 R：TTTATTATAAGTGATAAGATCTACAAGCAA GmWRKY148-MQF：CGGGGTACCATGCCTTTCCGAAATTCCAATATGA R：CGCGGATCCTCATATTTCATTTGGATATTGAGGA GmWRKY148-2F：ATGCACACAACCCACTTGCTGmWRKY148实时荧光定量PCRqRT-PCR of GmWRKY148 R：CAGATGAAGAGTTTCTCTTC GmEF1βF：GTTGAAAAGCCAGGGGACA疫霉积累量实时荧光定量内参Reference gene in qRT-PCR R：TCTTACCCCTTGAGCGTGG GmActinF：GGTGGTTCTATCTTGGCATC实时荧光定量PCR内参Reference gene in qRT-PCR R：CTTTCGCTTCAATAACCCTA pBinGFP2F：AAGACCCCAACGAGAAGCpBinGFP2载体引物Primer of vector R：GAACCCTAATTCCCTTATCTG

附表2 受疫霉菌丝侵染及产生卵孢子的大豆转基因发状根数目统计

Table S2 Summary of the numbers of roots that were successfully infected byor oospores development

24 hpi36 hpi48 hpi GFPOE-GmWRKY148GFPOE-GmWRKY148GFPOE-GmWRKY148 被成功侵染的大豆发状根数Number of roots infected7/203/2013/205/2016/209/20 萌发卵孢子的大豆发状根数Number of roots developed oospores3/200/206/202/2012/204/20

a：新鲜的菌丝边缘，切成小块贴于固体V8培养基，进行扩繁。b—f：培养2—6 d时，大豆疫霉菌P6497的生长情况

a: Choose fresh mycelium edges, then cut them into small pieces, to carry on the propagation. b-f:Growth situation of P6497, after 2 to 6 days

图S1 大豆疫霉菌P6497的培养

Fig. S1 Formation of mycelium of P6497

a：扩繁后4 d，大豆疫霉菌P6497的生长情况。b：取培养4d的大豆疫霉菌边缘部分，切成碎块放入液体V8培养基中进行培养。c：灭菌清水充分清洗，诱导产生游动孢子。d：继续培养10 h后，P6497的生长情况。e：过滤，得到透明的游动孢子液。f：大豆阳性发状根浸入游动孢子液

a: After 4 days of propagation, the growth situation of P6497. b: Choose fresh mycelium edges, cut them into tiny pieces, then put them into liquid V8 medium. c: Thoroughly clean the debris with sterile water. d: Growth situation of zoospores of P6497, 10h later. e: Strain the liquid through a piece of gauze, in order to get transparent zoospores fluid. f: Put positive soybean hairy roots in to zoospores fluid

图S2 大豆疫霉菌P6497游动孢子的培养

Fig. S2 Formation of zoospores of P6497

a、b、c：GFP转化大豆Williams的发状根。

a, b, c: GFP Williams hairy roots.

d、e、f：过表达GmWRKY148的大豆Williams发状根

d, e, f : OE-GmWRKY148 Williams hairy roots

图S3 扩繁的阳性发状根GFP荧光检测图片

Fig. S3 GFP fluorescence in enlarged positive transgenic soybean hairy roots

Cloning and Functional Analysis of the

WANG ShaSha, CUI XiaoXia, HUANG YanZhong, XUAN HuiDong, GUO Na, XING Han

(College of Agriculture, Nanjing Agricultural University/National Center for Soybean Improvement/Key Laboratory for Biology and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture/National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095)

【Objective】WRKY transcription factor is closely related to the biological and abiotic stress responses of plants. In order to study the function of,was cloned and its expression was analyzed, then the gene was over-expressed in soybean hairy roots for analyzing resistance to.【Method】Based on the sequence of, the homologous genewas obtained from the root tissue of soybean Williams 82 by method of homologous cloning, named. Phylogenetic analysis was performed. The transcriptional level ofunder four tissues andinfection was analyzed by qRT-PCR. For subcellular localization analysis, the recombinant plasmid pBinGFP2-was constructed, and transformed into onion epidermal cells by gene gun method. Transgenic soybean hairy roots were obtained by using-mediated method. The transgenic over-expressing hairy roots and empty-vector hairy roots were obtained by GFP fluorescence screening and qRT-PCR. To confirm whetheris involved in the interaction between soybean and, the positive soybean hairy roots were inoculated by P6497, and measured the lesions length, accumulation ofand the germination of oospores.【Result】The CDS ofis 999 bp, encoding 332 amino acids, and the isoelectric point is 7.61. Phylogenetic analysis indicated that the WRKYs fromandwere highly similar to GmWRKY148. Subcellular localization results showed that GmWRKY148 was located in the nucleus. Tissues expression analysis showed thathad the highest expression in roots, followed in stems and leaves, and lowest in cotyledons. qRT-PCR analysis showed that the expression level ofwas up-regulated upon infection byboth in resistant variety Williams 82 (containing the) and susceptible variety Williams, which has the highest expression at 24 h post infection. The transcript ofis higher in Williams 82 than that in Williams. Transgenic over-expressing hairy roots (OE-) and empty-vector hairy roots (EV) were inoculated withP6497 mycelium blocks, the lesions length and the accumulation ofwere compared after 24 h inoculation. The lesion length in OE-soybean hairy roots was significantly shorter than that in the EV, and the accumulation ofwas significantly reduced. The rate of mycelial infection and zoospores germination was observed by microscopy at 24, 36 and 48 h after inoculated withzoosporesCompared to the control EV, the rate of mycelia infection and zoospores germination of over-expressingsoybean hairy roots was significantly decreased.【Conclusion】is a positive regulator in the interaction between soybean and.

;;; resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.002

2018-04-11；

2018-06-19

国家重点研发计划（2017YFD0101500）、转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08004002-005）、大豆现代产业技术体系（CARS-004-PS10）、长江学者和创新团队发展计划资助（PCSIRT_17R55）、江苏省现代作物生产协同创新中心资助

王莎莎，E-mail：2015101138@njau.edu.cn。通信作者邢邯，E-mail：hanx@njau.edu.cn