晚期胰腺癌患者门静脉血循环肿瘤细胞检测的临床应用价值

陈 颐 刘霄宇颜志平程洁敏龚高全刘凌晓李国平李长煜周国锋余天柱王小林△

(1复旦大学附属中山医院介入治疗科 上海 200032; 2上海市影像医学研究所 上海 200032)

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指因自发或诊疗操作等原因脱离原发灶或转移灶进入血液循环的肿瘤细胞,在肿瘤转移的发生发展中起重要作用[1]。进入血液循环的CTCs由于受到免疫识别杀伤、血流剪应力破坏以及自身凋亡等因素影响,在外周静脉中的含量极低,通常认为一般肿瘤人群的外周血中每1亿个血细胞中仅有1个CTCs[2]。而消化系统血液由门静脉回流后,经肝脏滤过再进入外周静脉,外周静脉的CTCs含量更低[3]。Allard等[4]报道消化系统肿瘤外周血的平均CTCs计数为(2～24)/7.5 mL,低于人体其他系统的肿瘤,如前列腺癌(75/7.5 mL)、乳腺癌(84/7.5 mL)、膀胱癌(42/7.5 mL)。消化系统肿瘤中,胰腺癌外周静脉平均CTCs计数为2/7.5 mL,低于同样经门静脉引流的胃癌(24/7.5 mL)和结直肠癌(4/7.5 mL),这可能与胰腺癌组织中基质成分较多有关,与其他肿瘤相比,在同样条件下进入血循环的CTCs数量较少。以上因素成为胰腺癌的CTCs研究明显滞后于其他肿瘤的主要原因之一。

近年来,有研究人员在胰腺癌切除术中,分别抽取患者门静脉血和外周静脉血分离CTCs进行计数比较,发现门静脉的单位血样中CTCs检出率和计数均高于外周静脉[5-6]。因此,胰腺癌的CTCs研究有望通过获取CTCs含量较高的门静脉血样寻找突破口。但是门静脉系统在腹部较深位置,周围解剖结构复杂,通常情况下,难以获取晚期胰腺癌患者门静脉血,本研究采用介入微创方法穿刺肝内门静脉获取晚期胰腺癌患者门静脉血,以期获得较高丰度的CTCs,为胰腺癌CTCs的分子生物学和功能研究奠定基础。

资 料 和 方 法

病例队列纳入病例为2016年2月—12月于复旦大学附属中山医院介入治疗科接受治疗的晚期胰腺癌患者。纳入标准:(1)无法手术切除的晚期胰腺癌(依据NCCN 2016版);(2)ECOG评分<2分;(3)未接受过全身化疗、放疗等针对胰腺癌的治疗;(4)白细胞计数≥4×109/L,血小板计数≥100×109/L;(5)血清丙氨酸氨基转移酶≤1.5倍正常值、血清总胆红素≤1.5倍正常值(伴梗阻性黄疸的患者先行经皮经肝胆管引流);(6)肌酐≤115 μmol/L;(7)凝血酶原时间延长≤2 s。排除标准:(1)有肝脏穿刺禁忌症;(2)血管造影禁忌症;(3)患者有其他肿瘤病史;(4)预计生存期<3个月。本研究涉及的标本收集经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。

晚期胰腺癌门静脉血获取局部晚期病例如能在超声导引下穿刺原发灶,用21G超声穿刺针(日本八光公司)行原发病灶抽吸活检;伴肝转移病例,超声导引下用18G活检针(美国Cook公司)行转移灶穿刺活检。超声导引下用21G超声穿刺针,经右侧肋间经皮穿肝并穿刺进入门静脉右支主干,确认针尖位于门静脉腔内后拔除针芯,抽取门静脉血15 mL,拔除穿刺针,部分患者同时抽取外周静脉血7.5 mL。采用Seldinger穿刺法穿刺股动脉,行动脉化疗灌注/化疗栓塞术,术后常规心电监护6 h。

CTCs的富集打开CTChip芯片,记录芯片编号,微孔朝下放入到芯片卡槽中。使用ClearCell®FX1收集CTCs。

CTCs的涂片与染色配制抗体及相关试剂:一抗CD45,一抗CK18,二抗MS488,二抗RB568,DAPI溶液,4% PFA固定液,Trition×100穿透液。将细胞沉淀20 μL液体重悬后,加入到用免疫组化笔所画的区域内,放置通风处吹干;4% PFA固定液,固定15 min;Trition×100穿透液,充分接触1 h;PBS冲洗5 min,1次;一抗CD45和CK18室温静置30 min;PBS冲洗5 min,3次;加二抗溶液MS488和RB568,室温静置30 min;同样PBS冲洗5 min,3次;经DAPI/CK18/CD45染色后,在InCell仪器中查看时,肿瘤细胞应在蓝色和绿色通道呈现,白细胞应在蓝色和红色通道呈现(图1)。

CTCs:DAPI+/CK+/CD45-;WBC:DAPI+/CK-/CD45+(DAPI:blue;CK:green;CD45:red).

图1CTCs鉴定
Fig1CTCsidentification

CTCs图像获取与计数应用InCell Analyzer 2000获取CTC细胞图像及计算CTC数量。

CTCs的CD133表征(1)准备试剂:一抗CD133,CK18;二抗MS488,RB568;DAPI溶液;Trition 溶液;PBS溶液;Immuno Enhancer Kit稀释液,4% PFA固定液。(2)涂片固定与染色:将上述CTCs固定和染色中一抗替换成一抗CD133,CK18,余相同。(3)CD133+CTCs染色图像获取与计数:同上。

观察指标(1)术中观察动脉造影表现、有无出血征象、术后有无出血症状和体征。(2)部分患者门静脉和外周静脉CTCs分别计数,并进行比较。(3)所有患者门静脉CTCs计数,观察性别、年龄、CA19-9、CEA、原发灶是否侵犯门静脉系统,是否伴有肝转移、原发灶部位以及原发灶最大径和CTCs计数的相关性。(4)分别观察门静脉和外周静脉CTCs的CD133表征。

统计学方法采用EpiData 3.1软件录入患者基线数据和临床信息,分组比较采用Wilcoxon秩和检验或χ2检验。研究中数据缺失值不纳入分析。所有统计检验均为双侧检验,检验水准α设为0.05。所有相关性研究采用最小二称法拟合线性相关。

结 果

患者基本信息共计入组患者29例,其中男性19例、女性10例,平均年龄62.9岁(42～79岁),局部晚期16例、伴肝转移13例(表1)。17例患者胰腺癌诊断经病理证实,12例经影像学和血液生化检查证实。29例患者均成功获取门静脉血15 mL,术中肝动脉造影均未见造影剂外渗征象,术后亦未出现失血症状和体征。

表1 29例晚期胰腺癌患者临床病理资料Tab 1 Baseline characteristics of 29 patients with advanced pancreatic cancer

M:Male;F:Female;Y:Yes;N:No.

CTCs计数29例患者的门静脉血中均检测到CTCs,门静脉CTCs平均计数为(282±50)/7.5 mL。前期14例外周静脉取血的患者中,9 例(64.2%)患者外周静脉检测到CTCs,CTCs平均计数为(21±7)/7.5 mL。前期14例同时采集门静脉血和外周静脉血的患者门静脉CTCs平均计数为(237±78)/7.5 mL,显著高于外周静脉(P=0.010 2,图2)。

临床病理特征和CTCs计数的相关性分析(表2) 29例患者中,13例(45%)伴有肝转移的患者门静脉CTCs平均计数为(449±81)/7.5 mL;16例(55%)局部晚期患者门静脉CTCs计数为(126±18)/7.5 mL,肝转移患者门静脉CTCs计数显著高于局部晚期患者,门静脉CTCs数量与患者是否伴肝转移具有统计学相关性(P=0.000 4,图3)。

The mean count of CTCs in portal vein of (237±78)/7.5 mL was significantly higher than that in the peripheral vein blood of (21±7)/7.5 mL.

图229例晚期胰腺癌患者门静脉与外周静脉CTCs计数
Fig2CTCscountinportalveinandperipheralveinof29patientswithadvancedpancreaticcancer

表2 门静脉血CTCs计数和晚期胰腺癌患者临床特征的相关性Tab 2 The correlation between the CTCs count and the clinical characteristics of patients with advanced pancreatic cancer

17例(59%)原发病灶侵犯门脉系统患者的门静脉CTCs平均计数 (281±73)/7.5 mL,12例门静脉系统未受侵犯患者门静脉CTCs平均计数(282±66)/7.5 mL,两者差异无统计学意义(P=0.991 4)。29例患者原发肿瘤瘤体最大径1.8～6.0 cm,瘤体最大径与门脉血中CTCs计数无显著线性相关(图4)。

图3肝转移晚期胰腺癌患者门静脉CTCs计数显著高于无肝转移患者
Fig3ThemeancountinportalveinsamplesofCTCsinpatientswithadvancedpancreaticcancerandlivermetastasiswassignificantlyhigherthanpatientswithoutlivermetastasis

图4 胰腺癌患者门静脉血CTCs与原发肿瘤最大径的相关性Fig 4 The correlation between the number of CTCs and the tumor diameter

前期14例患者门静脉CTCs平均计数237/7.5 mL [(8～908)/7.5 mL],CD133+细胞1～95个,占5.9%(2.5%～12%),相应患者外周静脉CTCs未发现CD133+细胞(图5)。

讨 论

近年来,通过外科术中获取胰腺癌门静脉血,分离获得较高浓度的CTCs,使胰腺癌CTCs的研究看到了新的希望。本研究采用介入微创穿刺技术穿刺肝内门静脉,获取29例晚期胰腺癌患者门静脉血样均获得成功,未出现并发症。目前,已报道的唯一采用微创技术获取门静脉血进行CTCs检测的研究来自Catenacci团队[7]。与Catenacci等[7]的报道相比较,本研究采用超声导引,较超声内镜导引操作更为简便;21G穿刺针直径更细,操作也更为安全,更值得在临床上推广应用。本研究前期14例晚期胰腺癌患者平均门静脉CTCs明显高于外周静脉血的,表明胰腺癌的直接引流静脉内CTCs浓度较高,预示晚期胰腺癌的门静脉CTCs有着巨大的潜在研究价值,可以为胰腺癌CTCs的分子生物学和功能研究创造条件[8]。

A:DAPI+CK identified CTCs (white arrow);B:DAPI+CD133 identified CD133+CTC (white arrow);C:Merged figure (DAPI:Blue;CK:Green;CD133:Red).

图5门静脉部分CTCs表达CD133
Fig5CD133+CTCsinportalvein

本研究伴肝转移患者门静脉CTCs计数明显高于局部晚期患者(P=0.000 4),这直接表明了门静脉CTCs和肝转移的相关性。有学者在其他消化道肿瘤的研究中得到相似的结果,Rahbari等[9]获取同属门静脉系统的肠系膜上静脉血液,发现Ⅲ期和Ⅳ期结直肠癌患者的CTCs检出率有显著差别。CTCs是介导肿瘤转移的基础,通过动态监测门静脉CTCs,预判胰腺癌患者微转移的发生,以及晚期患者病程中是否会出现转移,具有重要的临床研究价值[10]。

生物法和物理法是目前最常采用的两种CTCs的富集技术[11]。CellSearch®系统是生物法中免疫吸附技术的代表,它可以捕获上皮表型-上皮细胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)表达阳性的CTCs,是目前唯一经FDA批准用于转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌预后判断CTCs检测系统[12-14]。但是,CTCs在生成和转移的过程中会产生上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),也就是肿瘤细胞失去极性、黏附性等上皮表型,转化为代表较高迁移侵袭能力的间质表型,从而具有更强的侵袭转移能力[15]。CellSearch®系统会遗漏具有间质表型的CTCs,无法完整分析整个CTCs群体特征。Khoja等[16]同时使用CellSearch®系统和属物理法的ISET系统检测了27例胰腺癌患者,并进行比较,发现ISET系统的CTCs检出率为93%,而CellSearch®系统的检出率仅为40%。ISET系统检出的病例中,有9例为EpCAM阴性,3例为EpCAM弱表达。因此,CellSearch®系统检出的EpCAM阳性CTCs仅为CTCs中的一个亚群。本研究采用的ClearCell®FX系统的分离过程不会对CTCs造成损伤,分离出的CTCs具有细胞活性,完全可以用于下游分子检测、细胞培养、细胞水平研究和肿瘤动物模型建立等实验[17-18]。值得注意的是,具有间质表型的CTCs可能更具侵袭性。有研究者分析了乳腺癌患者血样中的EpCAM阴性CTCs[19],发现其中HER/EGFR/HPSE/Notch表达均为阳性的亚群具有较高的致瘤性,并证实这部分无法被CellSearch系统检出的CTCs在裸鼠体内可以导致转移灶的形成。本研究中所有病例均为晚期胰腺癌,同一肿瘤人群中,晚期患者具有间质细胞表型的CTCs细胞比例明显高于早期患者[20]。

在其他肿瘤的CTCs研究中已经发现,有干细胞特征的CTCs和患者预后呈负相关,具有致瘤性和对化疗药物更强的耐受性[21-23]。CD133是一种跨膜糖蛋白,最初发现其在人体造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等干细胞群中有一致的表达。目前研究表明,结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中均有CD133+的肿瘤细胞亚群,已成为多种实体肿瘤干细胞主要标志物之一[24]。肿瘤细胞群中,表达CD133的亚群拥有更强大的自我更新、侵袭转移和致瘤能力[25-26];肿瘤人群中,CD133的表达和患者的预后呈负相关[27-29]。目前仅有通过CD133表征观察胰腺癌外周静脉血CTCs的研究报道[29]。本研究门静脉血中CD133+CTCs为5.9%,表明晚期胰腺癌患者的门静脉CTCs中存在干细胞特征细胞亚群;外周静脉血未发现CD133+CTCs,可能由于门静脉CTCs经过肝脏的“滤过”、机体免疫杀伤或自身凋亡,在外周静脉血中数量明显减少,已无法检出CD133+CTCs。这一结果提示胰腺癌的直接引流静脉-门静脉血样中的CTCs较外周静脉更具有研究价值。

综上所述,晚期胰腺癌患者的单位门静脉血CTCs计数明显高于外周静脉,门静脉CTCs计数与是否伴有肝转移相关。晚期胰腺癌患者门静脉CTCs中部分具有干细胞表征,具有潜在研究价值。