怀山药酵素粉的制备及抗氧化作用

费 鹏 杨同香 赵胜娟 徐云凤 陈俊亮 李芳梅 康怀彬

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

怀山药又被称为山药、白山药，肉质细嫩、营养丰富、富含必需氨基酸及钾、镁、钙、铁、锌、VC、VA、视黄醇、胡萝卜素等多种微量元素[1-2]。经常食用怀山药可以预防脂肪堆积、降低胆固醇、增强免疫功能、提高记忆力、消除神经疲劳、调节神经失调、调节更年期症状[3-4]。随着人们对怀山药营养价值和保健功能的认可，如何提高怀山药产品的多样性，充分开发其保健功能成为了目前需要解决的问题。

植物酵素是以一种或多种新鲜蔬菜、水果、谷豆、海藻、药食两用本草等食材为原料，加(或不加)糖类物质，经过较长时间发酵而得到的功能性发酵产品[5-6]。经过长时间的发酵，酵素会产生多种有益于人体健康的生物活性物质，如酚类、黄酮类、有机酸类、多糖类以及酶类等，这些生物活性物质能够清除机体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤，从而改善人体机能[7-9]。Sulasiyah等[10]利用米曲霉发酵姜黄，并通过清除自由基能力的评估、总酚的测定和植物性化学物质的筛选评价其抗氧化能力，结果发现姜黄酵素的抗氧化活性随着发酵时间的延长而显著增加。Oladeji等[11]发现玉米胚乳酵素中总类胡萝卜素和VC的含量显著增加，提高了其对自由基、二铵盐和脂质过氧化物的清除能力。Jgf等[12]制备了葡萄皮酵素，并发现经过发酵的葡萄皮中总酚的含量显著增加，抗氧化能力显著提高，从而有助于内皮依赖性血管扩张。此外，西兰花[13]、海棠果[14]、麦苗[15]、纳豆[16]、蓝靛果椰子复合酵素[17]等植物酵素的制备及抗氧化的研究也已被报道。

目前，怀山药的酵素产品尚未见报道，本研究拟以怀山药为原料，利用植物乳杆菌发酵怀山药原液以发掘怀山药的益生功能，以怀山药酵素的抗氧化能力为指标，优化植物乳杆菌发酵怀山药的工艺参数，利用喷雾干燥技术制得怀山药酵素粉，并对怀山药酵素粉清除超氧阴离子和羟自由基的能力进行评估。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

怀山药：洛阳丹尼斯超市；

植物乳杆菌(LaobacillusplantarumKLDS-511)：东北农业大学食品学院菌种库；

茚三酮、邻苯三酚、硫酸亚铁、苯酚、邻二氮菲、VC等：分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；

30%双氧水溶液：陕西三桥精细化工有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子分析天平：HZK-FA210S型，上海精学科学仪器有限公司；

喷雾干燥机：SP-1500型，江苏互帮干燥设备有限公司；

紫外/可见分光光度计：UV-1100型，深圳市信之邦仪器设备有限公司；

电热恒温隔水式培养箱：BG-160型，上海知楚仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 怀山药酵素粉的制备流程

(1) 怀山药预处理：清洗、去皮，切片，护色，加水打浆，糊化，过滤，冷却，备用

(2) 怀山药酵素的制备：怀山药汁，调配(加糖)，均质，杀菌，冷却接种，发酵(恒温箱发酵)，恒温加热(25 ℃)，检测(测各条件下吸光度值，计算出SOD活性值)，喷雾干燥，成品

1.2.2 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)活力的测定 取发酵好的怀山药酵素液5 mL置于烧杯中，加入3 mL、0.05 moL/L的磷酸缓冲液，在25 ℃下离心20 min，取上清液。采用邻苯三酚自氧化法[18]测定样品SOD酶活力。

1.2.3 单因素试验

(1) 糖浓度：在接种量4%、发酵时间24 h、发酵温度42 ℃ 下，分析糖浓度(6%，8%，10%，12%，14%)对怀山药发酵液SOD活性的影响。

(2) 接种量：在糖浓度10%、发酵时间24 h、发酵温度42 ℃ 下，分析接种量(3%，4%，5%，6%，7%)对怀山药发酵液SOD活性的影响。

(3) 发酵时间：在糖浓度10%、接种量4%、发酵温度42 ℃ 下，分析发酵时间(12，18，24，30，36 h)对怀山药发酵液SOD活性的影响。

(4) 发酵温度：在糖浓度10%、接种量4%、发酵时间24 h 下，分析发酵温度(36，38，40，42，44 ℃) 对怀山药发酵液SOD活性的影响。

1.2.4 正交试验 根据单因素试验的结果，进一步用L9(34)正交试验方案进行优化。以怀山药发酵液SOD活性值为指标，确定糖浓度、接种量、发酵时间、发酵温度的最优参数组合。

1.2.5 喷雾干燥 以最优参数条件下得到的怀山药酵素液为原料，利用喷雾干燥法制备怀山药酵素粉，进料量分别设置为300，350，400 mL/h，进料温度设置为140 ℃，最终得到颗粒度均匀的产品。将制得的怀山药酵素粉加水复原到原来的体积，测定其SOD活性，比较喷雾干燥前后酵素液SOD活性的变化。

1.2.6 怀山药酵素粉对超氧阴离子清除能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法[19]。以相同浓度的VC作为对照组，测定不同浓度怀山药酵素粉处理后的样品在320 nm波长下的吸光值，按式(1)计算怀山药酵素粉对超氧阴离子的清除率。

(1)

式中：

c1——超氧阴离子清除率，%；

A0——空白对照；

An——不同浓度怀山药酵素粉处理后的样品吸光度。

1.2.7 怀山药酵素粉对羟自由基清除能力的测定 采用H2O2/Fe体系反应法[20]。以等浓度的VC作为对照组，测定不同浓度怀山药酵素粉反应系统在536 nm下的吸光值，并按式(2)计算怀山药酵素粉对羟基自由基的清除率。

(2)

式中：

c2——羟基自由基清除率，%；

A0——空白对照；

A1——只添加H2O2的吸光度；

A2——只添加怀山药酵素粉的吸光度；

A3——添加怀山药酵素粉和H2O2的吸光度。

1.2.8 数据分析 试验数据利用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，选择 Tukey’s 检验，当 P<0.05 时差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 糖浓度对怀山药酵素液SOD活性的影响 由图1可知，怀山药酵素液SOD活性随着糖浓度的增加先升高再降低，糖浓度为12%时SOD活性最高；当糖浓度大于12%，SOD活性开始下降，这是因为高浓度的糖会造成怀山药液体系渗透压升高，不利于植物乳杆菌的发酵，因此，糖浓度为12%最佳。

图1 糖浓度对怀山药酵素液SOD活性的影响

图1 Effect of sugar concentration on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.1.2 接种量对怀山药酵素液SOD活性的影响 由图2可知，怀山药酵素液SOD活性随着植物乳杆菌接种量的增加而增加，当接种量达到5%后SOD活性趋于稳定，可能是怀山药混合液中的碳源在5%发酵剂的作用下已经被全部消耗，在这种情况下，即便增加发酵剂SOD的活性也不会提高，因此，接种量为5%最佳。

图2 接种量对怀山药酵素液SOD活性的影响

图2 Effect of inoculum concentration on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.1.3 发酵时间对怀山药酵素液SOD活性的影响 由图3可知，怀山药酵素液SOD活性随着发酵时间的延长而增加，当发酵时间大于30 h时SOD活性不再继续增加，说明怀山药酵素液已经发酵完成。因此，发酵时间为30 h最佳。

2.1.4 发酵温度对怀山药酵素液SOD活性的影响 由图4可知，怀山药酵素液SOD活性随着发酵温度的上升先增加后减少，当发酵温度为42 ℃时SOD活性最高。因此，发酵温度为42 ℃最佳。

图3 发酵时间对怀山药酵素液SOD活性的影响

图3 Effect of fermentation time on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

图4 发酵温度对怀山药酵素液SOD活性的影响

图4 Effect of fermentation temperature on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.2 正交试验

利用L9(34)正交试验因素优化怀山药酵素的发酵条件，正交试验因素与水平如表1所示，试验结果如表2、3所示。

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验结果表Table 2 The orthogonal test results table

表3 正交试验方差分析表†Table 3 Orthogonal test analysis of variance

† ** 表示因素对试验结果具有极显著的影响(P<0.01)。

由表2可知，4个因素对怀山药酵素液SOD活性的的影响顺序为：接种量>发酵时间>发酵温度>糖浓度。怀山药酵素液的最佳因素水平组合为糖浓度12%、接种量6%、发酵时间30 h、发酵温度42 ℃。由表3可知，接种量、发酵时间、发酵温度对怀山药酵素液SOD活性的影响极显著(P<0.01)。

2.3 验证实验

按照最佳因素水平A2B3C2D2进行3次怀山药酵素液制备实验，怀山药酵素液的SOD活性分别为15.38，15.32，15.35 U/mL，3次实验的平均值为15.35 U/mL，高于正交试验各组SOD活性，验证实验的变异系数(coefficientofvari-ation，CV)为0.20%，说明该最佳工艺稳定可行。

2.4 喷雾干燥前后SOD活性的比较

利用喷雾干燥将怀山药酵素液制备成粉，并比较怀山药酵素原液和同浓度下怀山药酵素粉复原液SOD活性，结果见图5。与怀山药酵素原液(SOD活性为15.35 U/mL)相比，怀山药酵素粉SOD活性(SOD活性为14.73 U/mL)稍有下降，但不显著(P>0.05)。说明虽然怀山药酵素原液在喷雾干燥中会受到高温的破坏，但是由于时间较短，怀山药酵素原液中的活性物质并没有被显著破坏，因此可以利用喷雾干燥制备怀山药酵素粉。

图5 酵素原液和复原酵素液中的SOD活性比较

图5 Comparison of SOD activity between ferment liquid and recovery ferment liquid

2.5 怀山药酵素粉对超氧阴离子的清除能力

对超氧阴离子的清除能力是衡量怀山药酵素粉抗氧化能力的重要指标之一，如图6所示，怀山药酵素粉对超氧阴离子的清除能力与其浓度呈正比，0.35 mg/mL的怀山药酵素粉能够清除83.56%的超氧阴离子，稍低于VC的清除能力，说明怀山药酵素粉具有较强的清除超氧阴离子的能力。

图6 怀山药酵素粉对超氧阴离子的清除率

图6 Superoxide anion scavenging rate of Chinese yam ferment powder

2.6 怀山药酵素粉对羟自由基的清除能力

羟自由基清除率是评估怀山药酵素粉抗氧化能力的另一个重要指标，如图7所示，怀山药酵素粉的羟自由基清除能力略低于VC对照组，且随着酵素浓度的增加而提高。当怀山药酵素粉的质量浓度达到0.6 mg/mL时，羟自由基的清除率达到90.88%，说明怀山药酵素粉具有较强的羟自由基清除能力。

图7 怀山药酵素粉对羟自由基的清除率

图7 Hydroxyl free radical scavenging rate of Chinese yam ferment powder

3 结论

本研究优化了怀山药酵素粉制备的工艺参数。结果表明，影响怀山药酵素粉SOD活性的顺序为：接种量>发酵时间>发酵温度>糖浓度，最佳发酵工艺为糖浓度12%、接种量6%、发酵时间30 h、发酵温度42 ℃。此条件下怀山药酵素液SOD活性为15.35 U/mL，且经过喷雾干燥制备成怀山药酵素粉后其SOD活性没有显著变化。此外，抗氧化活性试验显示0.35 mg/mL的怀山药酵素粉复原液能够清除83.56% 的超氧阴离子，0.6 mg/mL怀山药酵素粉复原液能够清除90.88%的羟自由基，可见本试验制备的怀山药酵素粉具有良好的抗氧化能力。

本试验中制备怀山药酵素粉采用了喷雾干燥的方法，虽然通过分析能够发现喷雾干燥并没有显著地影响怀山药酵素的抗氧化性，但一定程度上降低了产品SOD的活性，因此在后续的研究中将采用真空冷冻干燥技术制备怀山药酵素粉，尽可能地保护产品中的功能成分。此外，本研究只对怀山药酵素粉的抗氧化活性进行了评估，并没有对该产品的具体生理功能进行探究。理论上抗氧化活性是生物活性成分发挥益生功能的理论基础，因此在接下来的研究中会针对性地挖掘怀山药酵素粉的生理功能。