硫辛酸分子印迹膜及其抗氧化效果

杨博文陈玉芹朱秋劲,2

(1. 贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025)

分子印迹技术(Molecular imprinting technology, MIT)起源于抗体抗原识别理论[1]，能够识别生物和化学分子，是多功能且具有广阔前景的技术。由于MIT在聚合过程中形成的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)具有特异性识别位点和记忆模板分子的功能，同时拥有较好的化学稳定性、结构稳定性和预定性，常被用于制作能够响应外界刺激的智能化学物质和药物输送材料[2-3]。刺激响应MIPs可以处理多种形式的释放或吸附行为，具有响应pH、温度、离子强度、电场、特定的浓度梯度变化达到调节释放的效果，MIT是活性包装发展的一个重要方向[4-6]。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid, ALA)化学名称为1,2-二硫戊环-3-戊酸，主要存在于微生物细胞、动物肝脏及菠菜等植物之中，是一种抗氧化能力很强的天然抗氧化剂，可清除多种自由基。α-硫辛酸和其还原态产物二氢硫辛酸在生物体内的相互转化和代谢再生过程中能清除各种类型的自由基，因此被称作“万能抗氧化剂”[7-8]。在化妆品中，ALA起阻断黑色素形成、美白、抗衰老等作用[9]。在食品领域，ALA作为营养补充剂添加至肉鸡的饲料中，可以使脂质过氧化程度减少，肉的TBARS值降低，拥有更好的感官性状[10-11]。部分研究[12-13]也表明，ALA具有很好的抗氧化效果。

由于ALA存在稳定性较差、不耐光和热、容易在分解过程中产生异味，限制了其在食品领域的应用，使用MIT制作硫辛酸分子印迹聚合物(ALA-MIPs)，可以减少ALA损耗以及异味的产生。除微生物腐败以外，食品的品质主要受贮藏环境以及脂质氧化的影响，尤其是脂质的多不饱和程度会加剧氧化过程[14]，在高脂肪含量食品的加工、包装和贮存过程中是导致膳食脂质降解的主要问题。抗氧化剂可以有效地限制氧气进入肉中，防止脂质氧化和肉类风味品质恶化[15]，将ALA与活性包装技术结合能够更有效地起到抗氧化作用[16]。硫辛酸MIPs以异相粒子填充法制备成分子印迹膜(Molecularly imprinted membrane, MIM)，既可以温敏性释放ALA，又能够利用包装减少氧气接触，起到更好的抗氧化效果。分子印迹膜可以运用于肉类、油脂等高脂质食物抗氧化，以及化妆品等多个领域。

本试验拟采用本体聚合法，以ALA为模板分子，N-乙烯基己内酰胺(NVCL)为温敏单体和功能单体，制备ALA-MIPs。然后选用聚丙烯腈(PAN)和聚偏氟乙烯(PVDF)作为成膜材料，以异相粒子填充法制备MIM，研究分子印迹膜的机械性能、温敏性能及抗氧化效果。以期为温敏性分子印迹膜材料的开发，以及在高油脂含量食品的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料与试剂

α-硫辛酸(ALA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)：99%，美国Sigma-Aldrich公司；

N-乙烯基己内酰胺(NVCL)：98%，美国Sigma-Aldrich公司；

偶氮二异丁腈(AIBN)：99%，阿拉丁试剂有限公司；

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

聚丙烯腈(PAN)：分析纯，克拉玛尔上海谱振生物科技有限公司；

聚偏氟乙烯(PVDF)：99.5%，美国杜邦公司。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：1260 Infinity II HPLC型，美国安捷伦公司；

微机控制电子万能试验机：A2013037型，中国美斯特工业系统有限公司；

标准型接触角测量仪：DSA25型，德国克吕士公司；

扫描电镜：Hitachi S-3400N型，日本日立有限公司；

小型涂布机：DP104987型，北京亚欧德鹏科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 分子印迹聚合物(MIPs)的制备 根据文献[17]，修改如下：将功能单体改为NVCL，并改变ALA与NVCL的摩尔比例为1∶4。

1.2.2 分子印迹膜(MIM)的制备 使用异相粒子填充膜法[18]，分别称取一定量预先干燥好的聚丙烯腈(PAN)和聚偏氟乙烯(PVDF)加入到盛有25 mL DMF的锥形瓶中，65 ℃ 恒温加热搅拌使之完全溶解，然后加入MIPs，恒温、恒速搅拌，直到溶液均匀稳定，即得到铸膜液。将铸膜液放入真空干燥箱中使其完全脱泡，静置一段时间。在室温下用平板涂布机将铸膜液匀速刮涂在玻璃板上，厚度为0.350 mm，然后将玻璃板置于凝固浴中成膜，浸泡一段时间，期间更换3次洗脱液除去DMF。空白非印迹聚合物膜的制备，除不加MIPs外，其他步骤同上。

1.2.3 膜厚度的测定 膜的厚度使用游标卡尺，随机测定薄膜的5个位置。

1.2.4 机械性能的测定 按ASTM-D882-91执行，将膜裁成1.8 cm×10 cm的长条，用微机控制电子万能试验机测量其厚度并做拉伸测定，夹具间初始距离为60 mm，拉伸速度为1 mm/s，引伸计分辨力为1 μm，测定条件为23.1 ℃，51.7% RH，每组薄膜取5个样品进行测定，结果取其平均值。拉伸力(TS)和断裂伸长率(EAB)按式(1)、(2)计算：

(1)

(2)

式中：

TS——拉伸力，N/mm2；

EAB——断裂伸长率，%；

N——膜断裂前承受的最大拉伸载荷，N；

a——膜的宽度，mm；

b——膜的厚度，mm；

L0——膜拉伸前长度，mm；

L——膜断裂前拉伸的长度，mm。

1.2.5 亲水性的测定 薄膜的亲水性通过接触角测试进行表征，将水滴(3 μL)小心地滴在膜表面，用接触角测量仪检测接触角。

1.2.6 吸湿率和水溶性的测定 将薄膜充分干燥，取干重为M0的膜在蒸馏水中浸泡 24 h，然后用滤纸迅速吸干表面水分，称其湿重(M1)，按式(3)计算吸湿率，测定3次取平均值。

(3)

式中：

H——吸湿率，%；

M0——膜的初始重量，g；

M1——膜吸水后的重量，g。

将膜烘干至质量不在发生变化后，量取50 mL蒸馏水倒入小烧杯中，将质量为Wi的膜在室温下放入蒸馏水中浸渍24 h，沥去浸渍液后于105 ℃干燥至恒重(Wf)，按式(4)计算水溶性(water solubility，WS)。

(4)

式中：

WS——膜的水溶性，%；

Wi——膜的初始重量，g；

Wf——膜的最终重量，g。

1.2.7 场发射扫描电镜(SEM) 将膜切成小片粘贴到样品台上，然后进行喷金镀膜处理，最后用扫描电镜观察，聚焦清晰后获取形貌和结构图像。

1.2.8 分子印迹膜的温敏释放特性研究 分别称取100 mg的分子印迹膜置于25 mL的锥形瓶中，加入5 mL乙腈密封后，将其置于恒温振荡器中，分别在15，20，25，30，35，40，45，50，55，60 ℃温度下，以70 r/min振荡24 h后，取1 mL 上层清液，利用HPLC法检测溶剂中ALA浓度，并按式(5)计算ALA的释放量。

(5)

式中：

Q——ALA的释放量，mg/g；

c——乙腈中ALA的浓度，mg/mL；

V——乙腈的体积，mL；

m——分子印迹膜的质量，g。

1.2.9 测定硫辛酸的高效液相色谱(HPLC)条件 检测器：紫外-可见光检测器；检测波长：215 nm；流动相：乙腈与水(用磷酸调pH为3.5，体积比为50∶50)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18(4.60 mm×250 mm，5 μm，pH范围1.0～8.0)。

1.2.10 分子印迹膜过氧化值(POV)的测定 将VE以0.05% 添加到100 g的菜籽油中，分子印迹膜的添加量为1 g，将油样放于20，40，60 ℃的培养箱中，每隔一定时间测定其POV。植物油中过氧化值按GB 5009.227—2016执行。

1.2.11 DMF的测定 参照文献[19]。

2 结果与分析

2.1 成膜材料和溶剂的筛选

选择合适的成膜材料添加比例对膜性能有很大的影响，本研究经过大量试验，比较了PAN、PVDF 2种成膜材料，选取了在室温下具有较好成膜特性，且能在平板涂布机上正常涂布的添加比例。PVDF是经FDA许可的食品接触材料(21 CRF 177.2510)，有较好的重复利用特性，常用于制作水处理超滤膜等，具有很好的安全性。PVDF添加量为8 g/100 g时能够在凝固浴中较好地成膜，低于这一比例在涂布后不易成膜且厚薄不一；高于12 g/100 g时，无法形成均匀稳定的铸膜液。PAN则在添加量低于12 g/100 g时，形成的膜脆性较大。因此，在不添加其他添加剂的情况下，本试验选取2种成膜材料的水平：PVDF为8，10，12 g/100 g；PAN为12，15，20 g/100 g，依次分别记为A、B、C、D、E、F 6个组。

另一个影响膜结构形态和性能的因素是溶剂的选择，溶剂与成膜材料必须有很好的互溶性且有较好的稳定性。能够溶解PAN或PVDF的有机溶剂有：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等[20]。本试验选用吸湿性小，毒性低，价格便宜，且对PAN和PVDF都具有很好溶解性的DMF作为溶剂。DMF性质稳定、可以与多数有机溶剂和水互溶，常被用于医药、农药、石油化工等行业中。制药工业中，DMF被用于比卡鲁胺(Bicalutamide)、比沙可啶( Bisacodyl)、维生素B6和头孢氨苄等药物的生产过程[21]；作为溶剂，ICH规定其残余量不得高于0.88%[22]。制备食品甜味剂三氯蔗糖(TGS)的过程中，由于DMF具有优良的性能，在很多合成方法中被普遍用作溶剂[23-25]。同时，由于DMF很容易被水浴除去，且DMF作为溶剂的残留量极少，采用HPLC和GC法检测DMF的检出限可以达到53 ng[26]，使得DMF适用范围更加广泛。本试验中，未洗脱的PAN膜中DMF的残余量为0.253 mg/g，PVDF膜中DMF的残留量为1.52 mg/g，进行3次水浴洗脱处理后，MIM中无DMF残留。

2.2 薄膜的机械性能研究

机械性能是包装膜的重要性能指标，食品和保健品包装需要较高的机械强度以承受运输保存过程中的外界压力，图1 为不同成膜材料对薄膜厚度变化的影响。随着PVDF添加量的增加，膜的厚度由0.072 mm增加至0.084 mm，铸膜液浓度对PVDF薄膜的厚度有着较大的影响；同时，加入MIPs之后，PVDF薄膜的厚度明显增加，可能是加入MIPs使薄膜内产生一些空腔。PAN薄膜的厚度随着添加量增加进一步降低；添加MIPs后，其厚度有不同程度的上升，这是由于PAN在凝固浴中成膜时，DMF的析出导致表面十分不规则，所以不同部位的厚度差异较大，从图1中也可看出MIPs组有更大的误差范围。

图1 成膜材料对薄膜厚度的影响Figure 1 Effect of film-forming material on film thickness

从图2可知，PVDF膜的机械性能整体高于PAN膜，尤其在抵抗形变方面，所有组的拉伸强度都随着铸膜液浓度上升而增加，膜的结构变得更为致密，内部结构间相互作用增加。对于PVDF膜而言，随着浓度上升其断裂伸长率却有所下降，可能是内部结晶结构变得更为致密，厚度更大[27]。PAN膜在15 g/100 g的浓度下显示了最佳的断裂伸长率，但PAN膜整体的拉伸特性及断裂伸长率要远低于PVDF膜。添加MIPs的PVDF薄膜中，其拉伸强度和断裂伸长率均呈明显下降趋势，可能是MIPs破坏了原本的结晶结构，使得原本的连续性被破坏[28]44-47。由于PAN膜本身疏松的结构，加入MIPs对其机械性能影响不大。

2.3 薄膜的接触角分析

图3为不同添加比例的PAN和PVDF膜的接触角图像。随着PVDF添加量从8 g/100 g上升至12 g/100 g，接触角从90.0°下降到83.3°，原因是低浓度铸膜液在成膜后致密程度较低，表面更为粗糙；随着MIPs的加入，其接触角增大，由于MIPs分子无法融于水，还可能堵塞了一些膜表面孔隙，使得接触角进一步增大。PVDF材料本身具有较强的疏水性，材料表面的粗糙程度的增大会导致疏水性增加[29]。PAN膜表面极为粗糙，接触角整体小于PVDF，尤其在12 g/100 g 的铸膜液浓度下，水滴会极快的渗入薄膜中，无法观测到接触角。这是由于PAN为亲水性材料，低浓度时内部孔隙较大，随着浓度升高，薄膜聚合物大分子间的相互作用力比聚合物与DMF溶剂之间的相互作用力要强，因此生成的晶核数量增加，膜结构变得密实，膜的孔径变小，从而膜对纯水透过的阻力增大，接触角也增大[28]20-21。

图2 成膜材料对薄膜拉伸强度和断裂伸长率的影响

图2 Tensile strength and elongation at break of different film-forming composition

图3 分子印迹膜的接触角Figure 3 The Contact angle of MIM

2.4 分子印迹膜的吸湿率和水溶性

如图4所示，PAN膜的吸水性要明显高于PVDF膜，这是由于PAN膜空气侧表面的孔隙较PVDF膜更大，更为粗糙；吸湿率随PAN浓度上升而降低，可能是内部空腔减少，水通量增加，导致吸湿率及水溶性减少。PVDF膜的吸湿率随浓度的增加而上升，这是由于在较低的铸膜液浓度下，将涂布后的玻璃板浸入凝固浴后，两相界面处聚合物浓度也低，导致分相后聚合物稀相占有较大的比例，因而膜的有效孔隙率和通量增加，吸湿率也随之增加[30]。

图4 成膜材料对薄膜吸湿率和水溶性的影响

图4 The moisture content and water solubility of different film-forming composition

在薄膜中加入MIPs之后，吸湿率都有所降低，这是由于MIPs粉末不溶于水，亲水性也较差，同时MIPs的结构也更为致密，使得水难以透过。同时MIPs的添加也使分子印迹膜的水溶性上升，可能是被嵌合在膜内的MIPs经过长时间浸泡和高温干燥之后脱落。在PAN(12 g/100 g)和PVDF(12 g/100 g)组中，前者松散的结构往往导致薄膜的物质被水洗脱，后者可能是被截留的溶液析出。

如图5所示，随着MIPs添加量的增大，PVDF和PAN组的吸湿率呈相反的变化，推测是2种膜本身结构特性所导致的。PVDF膜的结构十分致密，能够阻隔水的渗透；PAN膜则恰好相反。添加MIPs后，PVDF膜致密的结构被破坏，导致吸水率增加；而PAN膜内部的孔隙则被MIPs占据，使得其对于水的透过率相对而言有所下降，且MIPs总体的占比上升，使得吸湿率下降。

2.5 薄膜的表面形态表征

薄膜的微观结构能够揭示其机械性能、亲水性和接触角变化的原因。图6为PAN/ PVDF分子印迹膜的扫描电镜图。PAN膜的表面要比PVDF粗糙和起伏不平，溶液析出的孔径远大于PVDF，但表面材质更为均匀致密，玻璃板侧表面十分平滑。PVDF膜玻璃板侧表面可见致密的内部孔状结构，空气侧表面有随机分布小孔，但数量较少。加入MIPs后形态结构具有以下特点：PVDF表面更为粗糙，小孔减少，不规则缝隙较多，这也揭示了机械性能下降和吸湿性上升的原因；PAN膜表面出现不规则缝隙，孔径增大，同时也印证了薄膜接触角变化的原因。PVDF内部空腔结构更为致密，存在大量独立的小空腔，MIPs被包埋于小空腔内部，不利于ALA释放；PAN内部的空腔较大，MIPs被包埋于内壁之上，更利于ALA释放。

2.6 分子印迹膜在不同温度下的释放特性

图7为分子印迹膜在不同温度下对ALA的释放量，2种MIM都在20 ℃有释放量的极大值。NVCL原本的低临界温度(LCST)为38 ℃[31]，由于形成了复杂聚合物，合成MIPs后LCST为20～25 ℃。PAN膜的结构更为疏松，使得ALA在PAN分子印迹膜中的释放量普遍较高。PVDF分子印迹膜的结构相对更为致密，相对PAN膜，各个温度下的释放量都较低，但随着温度的上升ALA分子向溶液中释放的量增加，60 ℃时达到最大值，说明在PVDF中，ALA被基膜截留的部分较多，分子扩散运动的加速有利于ALA释放，与图6中观测的结果一致。

2.7 分子印迹膜在植物油中的抗氧化效果

图8为分子印迹膜在不同温度下对菜籽油的抗氧化效果，试验中添加VE作为比对。相比于VE，PVDF膜和PAN膜在所有温度下都有更低的POV值，但在60 ℃时由于添加量过低和氧化速率加快，MIM抗氧化并不理想。得益于较大的释放量和温敏释放ALA的效果，PAN膜20 ℃组将POV值稳定在较低的区间；40 ℃组到6 d时，POV值增长趋势略微上升，说明ALA的温敏性释放量不足。总体来说，PAN-MIM的抗氧化效果最好，且在20 ℃有最佳抗氧化能力。

图5 MIPs添加量对分子印迹膜吸湿率和水溶性的影响Figure 5 The moisture content and water solubility of the MIM in different adding amounts

MIPs的缓释应用和温敏性能够展现长期稳定的抗氧化效果，同时其特异性识别和反复利用特性使得MIT在食品领域的应用范围不断拓宽，从对食品中各种有毒物质、农药残留和添加剂的快速检测，发展到食品的预处理、去除食品中有害物质以及作为食品包装，如清除和预浓缩牛奶和鲜虾样品中的氯霉素和磁性纳米粒子食品包装，都体现了MIPs在食品领域的重要作用[32-33]。

图6 分子印迹膜的扫描电镜图Figure 6 The SEM images of MIM

图7 分子印迹膜在不同温度下的释放特性Figure 7 Release characteristics of the MIM at different temperatures

图8 添加MIM的菜籽油在20，40，60 ℃下的POV值Figure 8 The POV value of rapeseed oil in 20, 40 and 60 ℃ adding MIM

3 结论

本试验对制备的分子印迹膜的亲水性、机械性能、温敏性以及抗氧化性能进行表征，发现PAN和PVDF膜分别体现了较强的亲水性和疏水性，PVDF有更好的机械性能。PAN在添加量为20 g/100 g，MIPs添加量为2 g时机械性能较好，且吸湿率较低。2种MIM都在20 ℃左右对ALA表现出优异的温敏性释放，从而可实现对ALA的基于温度变化的控制释放， PVDF膜由于内部结构的截留，在60 ℃有最大释放量。PAN膜总体释放量更大，在菜籽油中的POV值低于VE，抗氧化效果最好。目前还没有学者对温敏性分子印迹抗氧化膜以及在食品包装上的应用进行相关研究，此项研究的重点在于开发具有温敏特性的分子印迹膜，利用其缓释特性释放抗氧化剂，并将其应用于食品的抗氧化当中。但是要制备出对不同温度段响应并且缓释抗氧化剂的分子印迹膜还需要做大量的工作：在温敏性能上，对不同温度段进行响应的MIPs及功能单体还需要进一步探索与研究；MIM中ALA的迁移机制、释放动力学和抗氧化效果的联系有待进一步研究。