丝蛋白肽醒酒活性组分分离纯化及其构效关系研究

袁 亮戴 军陈尚卫朱 松张学军张 平

(1. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3. 山东天九生物技术有限公司，山东 菏泽 274108)

蚕丝蛋白作为从蚕丝中提取出来的一种天然高分子化合物，具备良好的人体亲和性、无毒副作用、无过敏反应等特点[1]，已经广泛应用于食品、化妆品、生物制药、临床诊断治疗及医用材料等诸多领域[2-3]。

蚕丝蛋白肽中富含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等多种氨基酸，因氨基酸组成和排列的差异而表现出多种功能性，诸如醒酒护肝[4]、降血糖[5-6]、降血压[7]、抗辐射抗肿瘤[8-9]、止血与抗菌抗炎[10-12]、降胆固醇与降血脂[13-14]等。近年来对天然醒酒生物活性物质的研究日趋重视[15-17]，当人体摄入乙醇后，90%～98%的乙醇是以肝内氧化的形式在体内发生代谢反应；其他则通过发汗、排尿及呼气等方式排泄到体外，而且在该反应中，起重要作用的是乙醇脱氢酶(ADH)氧化体系。而该体系的反应需要氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的参与，在乙醇被氧化为乙醛的同时，NAD则被还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。由于该还原产物在340 nm处有吸收峰，因此可以根据NADH在单位时间内引起的吸光度变化率来计算ADH活性的变化[18]。

国内外不乏蚕丝蛋白水解物醒酒活性的研究报道，平林洁等[19]研究发现蚕丝蛋白水解物的醒酒作用明显强于单一的丙氨酸和甘氨酸；周凤娟等[20]研究进一步证明丝素肽具有显著醒酒和防醉效果；祝永强等[21]研究不仅表明丝素水解物在抗醉酒方面有一定效果，而且发现将其与VC和中药提取物混合后的效果尤为显著。然而，关于醒酒丝蛋白肽活性组分分离纯化及其构效关系的研究尚未见报道。本研究拟以醒酒活性为考察指标，将实验室酶解制备的丝蛋白肽，先用凝胶过滤色谱(HPGFC)进行粗分离，再用反相色谱(RP-HPLC)进一步分离，最终获得活性最强组分，经液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱联用分析，以获得其氨基酸序列，以期为开发新的肽类醒酒产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

蚕丝(silk)：粗蛋白氮含量为14.53%，江苏省东台市济民生物科技有限公司；

乙醇脱氢酶(ADH)：310 U/mg，美国Sigma公司；

氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)：98%，上海国药集团；

Sephades G-15：葡聚糖凝胶，美国GE公司；

Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶：2.4 AU/g，丹麦Novo公司；

乙腈：色谱纯，美国Fisher公司；

无水乙醇、三氟乙酸、CaCl2等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

旋转蒸发仪：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；

紫外分光光度计：TU-1 900型，北京普析通用仪器有限公司；

超高效液相色谱仪：Waters Acquity UPLC型，美国Waters公司；

超滤杯：YL-300型，上海羽令过滤器材有限公司；

质谱仪：Waters MALDI SYNAPT Q-TOF MS型，美国Waters公司；

恒流泵：HL-2S型，上海沪西分析仪器有限公司；

高效液相色谱仪：Waters 2545型，美国 Waters公司；

高速冷冻离心机：Avanti J-E型，美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 蚕丝蛋白粉制备 称取适量蚕丝，剪碎后置于烧杯中备用；加入40% CaCl2溶液煮沸60 min，8层纱布过滤后离心(10 000 r/min，10 min)，装入7 000 Da透析袋中流动水透析12 h后，再用蒸馏水透析12 h(每1.5 h换一次水)；超滤浓缩后，冻干得蚕丝蛋白粉。

1.2.2 蚕丝蛋白粉酶解单因素试验 以蚕丝蛋白粉的水解度为评价指标，选温度、pH值、底物浓度、加酶量(酶与底物比)以及时间进行单因素试验，确定各因素对评价指标的影响。

(1) 时间：固定温度60 ℃，pH值8.5，底物浓度5%，加酶量2.0%，考察时间(30，60，90，150，240，300 min)对蚕丝蛋白粉水解度的影响。

(2) 加酶量：固定温度60 ℃，pH值8.5，底物浓度5%，时间240 min，考察加酶量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%)对蚕丝蛋白粉水解度的影响。

(3) pH值：固定温度60 ℃，底物浓度5%，加酶量2.0%，时间240 min，考察pH值(7.5，8.0，8.5，9.0，9.5)对蚕丝蛋白粉水解度的影响。

(4) 温度：固定pH值8.5，底物浓度5%，加酶量2.0%，时间240 min，考察温度(45，50，55，60，65 ℃)对蚕丝蛋白粉水解度的影响。

(5) 底物浓度：固定温度60 ℃，pH值8.5，加酶量2.0%，时间240 min，考察底物浓度(2%，3%，4%，5%，6%，7%，10%)对蚕丝蛋白粉水解度的影响。

根据单因素试验结果，选取主要因素进行正交试验优化工艺条件。

1.2.3 HPGFC分离丝蛋白肽 HPGFC所用填料为 Sephadex G-15，凝胶柱尺寸：60 cm ×2.6 cm；紫外检测器波长：220 nm；洗脱液：超纯水；丝蛋白肽上样量：15 mL；上样浓度：30 mg/mL；流速： 1.0 mL/min。根据色谱图收集各组分，经旋转蒸发仪浓缩后，用冷冻干燥机冻干成粉，再根据体外醒酒活性高低进行筛选，将活性最强的组分继续分离。

1.2.4 RP-HPLC分离纯化 将初分后ADH激活率最强的 组分，用RP-HPLC进一步分离。色谱条件：色谱柱：Waters xBridgeTM Prep C18(250 mm×19 mm，5 μm)；柱温：室温；流动相：A纯乙腈，B超纯水(0.05%TFA)；梯度洗脱条件：0～30 min，5% A～20% A；30～50 min，20% A～50% A；50～53 min，50% A；53～55 min，50% A～5% A；55～60 min，5% A；检测波长： 220 nm；流速：10 mL/min；样品浓度：50 mg/mL；进样量：500 μL。将分离后得到的组分浓缩冻干后测定ADH激活率。

1.2.5 水解度测定 采用pH-stat法[22]，水解度按式(1)计算：

(1)

式 中：

DH——水解度，%；

B——消耗的NaOH量，mL；

Nb——NaOH摩尔浓度，mol/mL；

a——氨基平均解离度，a=10pH-pK/(1+10pH-pK)，其中pK为氨基酸的平均pK，按7.0算(平均解离常数)，pH为反应起始pH值；

m——蚕丝蛋白质量，g；

htot——底物中肽键总数，丝素htot=12.4 mmol/g。

1.2.6 体外醒酒活性——乙醇脱氢酶(ADH)活力的测定

采用瓦勒-霍赫(Valle&Hoch)[23-24]法，并以0.5 mL蒸馏水代替乙醇溶液作参比调零；以0.1 mL蒸馏水代替0.1 mL 丝蛋白肽作对照组。ADH的活力值(U)按式(2)计算：

(2)

式中：

EADH——酶活，U；

△A——吸光度每分钟的增加值；

3.2——反应体系的总体积，mL；

w——加酶浓度，mg/mL；

6.2——NADH在340 nm处的摩尔吸光系数。

ADH激活率按式(3)计算：

(3)

式中：

R——ADH激活率，%；

E试验——丝蛋白肽试验组ADH酶活，U；

E对照——空白对照组ADH酶活，U。

2 结果与分析

2.1 蚕丝蛋白酶解工艺条件研究

2.1.1 酶解蚕丝蛋白单因素试验 由图1可知：

(1) 随着酶解时间的延长，水解度不断提高，但150 min后增幅明显回落，240 min后渐趋平缓。因此，为制备含量较高的丝蛋白肽产品，综合考虑制备效率，最终选择 240 min为酶解最适时间。

(2) 加酶量超过2.0%后，酶解过程的影响幅度较小，基本达到平衡状态，考虑制备成本，本试验最终选择2%加酶量作为碱性蛋白酶水解蚕丝蛋白的最适加酶量。

(3) 随着pH值由7.5提高到9.5，水解度变化幅度较大；当pH从7.5提高到8.5时，水解程度逐渐增大；pH从8.5 提高到9.5时，水解程度逐渐降低；在pH为8.5时，水解程度最大，因此，最终确定反应最适pH为8.5。

(4) 当温度从45 ℃提高到70 ℃时，蛋白水解度呈先增大后降低的趋势；60 ℃时达到最大值(23.22%)，但温度继续上升反而不利于酶解，这是因为Alcalase酶在高温下可能部分变性而导致酶活减弱。

(5) 随着底物浓度提高，水解度先不断增大、之后开始下降，底物浓度为5%时水解度达到最大值，因此，确定最适底物浓度为5%。

2.1.2 酶解蚕丝蛋白正交试验 根据单因素试验结果，本研究选取对蚕丝蛋白水解度影响较大的3个因素即加酶量、pH值及底物浓度，每个因素分别设计3个水平(见表1)进行正交试验，试验结果见表2。正交试验表明，3个因素对酶解反应的影响顺序依次是底物浓度>加酶量>pH值，最优组合为C2A2B2，即底物浓度5%，pH值8.5，加酶量2.0%，在此条件下水解度达到最大值(23.22%)。

2.2 丝蛋白肽浓度对体外醒酒活性的影响

根据瓦勒-霍赫(Valle&Hoch)的方法，将丝肽浓度设定5组梯度分别为1，2，4，6，8 mg/mL，每组浓度梯度设置3个平行试验，分别测定各组丝肽溶液的体外醒酒活性，结果见图2。从图2可以看出，ADH激活率随着丝蛋白肽浓度的增加表现出先上升后下降的趋势，当浓度为2 mg/mL时，ADH激活率达到最大值[(24.44±0.70)%]。

2.3 丝蛋白肽分离纯化

2.3.1 HPGFC分离纯化 丝蛋白肽经HPGFC分离色谱图如图3所示，根据保留时间不同，本研究分别收集了图3中1、2、3(SFP-Ⅰ、SFP-II、SFP-Ⅲ)3个组分，经浓缩、冻干后分别测定其体外醒酒活性。HPGFC分离组分体外醒酒效果如图4所示，组分2(SFP-II)的ADH激活率最高，为(31.69±1.9)%。多次收集组分2浓缩、冻干后进一步采用RP-HPLC进行分离纯化。

表1 正交试验设计表Table 1 Design of the orthogonal test

图1 时间、加酶量、pH、温度及底物浓度对蚕丝蛋白水解度的影响

图1 Effect of time, enzyme dosage, pH, temperature and substrate concentration on degree of hydrol-ysis of silk fibroin

表2 L9(33)正交试验设计及结果Table 2 Design and results of L9(33)orthogonal test

图2 不同浓度的丝蛋白肽对体外醒酒活性的影响Figure 2 Effect of concentration on ADH activation rate of silk fibroin peptide

图3 HPGFC分离丝蛋白肽Figure 3 Separation of silk fibroin peptide by HPGFC

2.3.2 RP-HPLC分离纯化 采用RP-HPLC对HPGFC初分筛选出的体外醒酒活性较强组分SFP-II进行分离纯化，可得到17个不同组分，结果见图5。反复收集经超滤浓缩、冻干后的17个组分，分别测定其体外醒酒活性，结果见图6。从图6可知，RP-HPLC分离获得的8号组分(SFP-II-8)体外醒酒活性最高，可达44.51%。

图4 HPGFC分离组分的体外醒酒效果Figure 4 Effect of fractions separated by HPGFC on anti-alcoholism in vitro

图5 RP-HPLC分离SFP-IIFigure 5 Separation of SFP-II by RP-HPLC

图6 RP-HPLC 分离组分的体外醒酒效果Figure 6 Effect of fractions separated by RP-HPLC on anti-alcoholism in vitro

2.4 SFP-II-8活性组分氨基酸序列分析

将SFP-II-8号组分经LC-MS/MS分离分析，可得到其Q-TOF二级质谱图，结果见图7。采用Biolynx软件对该组分的碎片离子进行解析，可得到其氨基酸序列解析图，结果见图8。从图8可知，SFP-II-8相对分子质量为473.4，其氨基酸序列为L-G-G-V-G-A。

3 结论

(1) 酶解条件优化试验结果显示，蚕丝蛋白制备丝蛋白肽的最佳工艺为：酶解时间240 min、加酶量([E]/[S])2.0%、pH 8.5、温度60 ℃、底物浓度5%，该工艺条件下蚕丝蛋白水解度为23.22%。瓦勒-霍赫法测定的体外活性试验结果表明，蚕丝蛋白水解液具有一定的醒酒活性，且不同浓度的丝蛋白肽的ADH激活率有所差异，浓度为2 mg/mL时醒酒活性较高。将丝蛋白肽经过HPGFC和RP-HPLC分离纯化，可分别得到3，17个组分，其中SFP-II-8级分ADH激活率最高，可达44.51%；SFP-II-8经UPLC-Q-TOF-MS分析得到其氨基酸序列为L-G-G-V-G-A。本研究为进一步开发、优化蚕丝蛋白资源和研究丝蛋白肽的醒酒活性提供了新的依据。

图7 SFP-II-8主峰的Q-TOF二级质谱图Figure 7 MS/MS spectrum of the major component of SFP-II-8

图8 SFP-II-8的氨基酸序列解析图(m/z=473.4)Figure 8 Amino acid sequence analysis diagram of SFP-II-8

(2) 本研究对丝蛋白肽的醒酒活性仅做了体外试验，有待后续进一步通过动物试验确证其生物活性。此外，分离分析得到的具有较高醒酒活性的丝蛋白肽组分的氨基酸序列还有待于通过化学合成该序列肽及其色谱-质谱分析和活性试验进行验证。